分子診断とは、DNA、RNA、またはタンパク質分子を診断材料として使用し、人体内の内因性遺伝子または外因性（病原体）遺伝子の存在、欠陥、または異常な発現を調べることによって、人間の状態または病気の特定の診断を行う方法およびプロセスです。主な分子診断技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、遺伝子チップ、および遺伝子シーケンシング技術があります。ハイブリダイゼーションおよびハイスループットシーケンシング技術と比較した場合、PCR技術の主な利点は、感度が高く、特異性が強く、操作が簡単で、普及しやすいことです。PCR技術は検出できる遺伝子の数に一定の制限がありますが、短期的には分子診断の主流技術であり続けるでしょう。
分子診断PCR増幅ワークフローと原材料の概要
1、コア酵素材料-Taq DNAポリメラーゼ
アプリケーションテスト分野の拡大と市場需要の増加に伴い、野生型の Taq DNA ポリメラーゼではもはや要件を完全に満たすことができません。
- 優れた安定性: プライマーとプローブを含む完全なプレミックス溶液に配合されており、37°C で 7 日間処理した後でも、低濃度検出に変化はありません。
図1：HBV核酸をテンプレートとして、10726ESでqPCR完全プレミックス溶液を調製し、テンプレート以外のすべての成分を37°Cで7日間加速安定性試験しました。結果は、高濃度、中濃度、低濃度でCt値と蛍光値に大きな変化が見られなかったことを示しており、10726ESで調製したプレミックス溶液は安定した性能を持っていることを示しています。
- 宿主 gDNA 残留量が少ない: 残留大腸菌ゲノム DNA は 100 U あたり 0.5 コピー未満です。
図 2: E. coli ゲノム DNA の線形範囲: 30 fg/μL ～ 300 pg/μL、相関係数 R2 は 0.9999。(B) Hieff UCF.ME® Sensitive Taq DNA ポリメラーゼの 3 つのバッチにおける残留 E. coli ゲノム DNA は、100 U あたり 0.5 コピー未満です。
2、コア酵素物質-逆転写酵素
RT-qPCR 反応の主要コンポーネントの 1 つである逆転写酵素は、より速い逆転写速度、より高い合成収率、およびより優れた耐熱性を備えている必要があります。RT-qPCR により適した逆転写酵素を得るために、
- 58℃の反応温度に耐えることができ、複雑なRNAテンプレートの逆転写に適しています。
図 3: Hifair® V 逆転写酵素と輸入ブランドの T* 逆転写酵素を 55°C と 58°C で 30 分間インキュベートし、残留酵素活性を検出しました。結果は、Hifair® V 逆転写酵素が 58°C で 30 分間インキュベートした後も 70% の活性を維持し、輸入ブランドを大幅に上回っていることを示しています。
- RT-qPCRでは他のブランドと比較して優れた検出率を誇り、検出範囲は1 pg～1 μgです。
図 4: 1 pg から 1 μg までの濃度 (7 段階) の 293T 細胞全 RNA をテンプレートとして使用し、Hifair® V ワンステップ RT-gDNA 消化 SuperMix for qPCR (カタログ番号 11142)、V*、および T* を使用して逆転写を行いました。得られた cDNA は、定量分析のために qPCR にかけられました。結果は、11142ES の感度が 1 pg に達し、競合製品よりも優れた検出率であることを示しています。
3、その他の酵素および酵素阻害剤：RNase阻害剤、UDG酵素
RNase阻害剤：
ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG/UNG酵素）：ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG酵素）は、dUTPと組み合わせて使用することで、PCR汚染防止システムを確立できます。易勝の熱不安定性、低UDG酵素は、従来のUDG酵素の不活化後の残留活性を回避し、室温でdUを含む増幅産物の劣化を引き起こす可能性があります。また、分子酵素に存在する背景細菌によって引き起こされるPCR結果の偽陽性も防止します。これは、感染性病原体を正確に識別し、感染症や伝染病の臨床診断を支援するために不可欠です。
Taq DNAポリメラーゼ抗体：非特異的増幅はPCRの性能に大きく影響する主要な問題の1つであり、ホットスタート技術は非特異的増幅を効果的に低減できます。抗体で修飾されたホットスタート酵素は、高い密封効率と優れた性能を備え、室温で安定しており、酵素活性の放出速度が速いです。 Yisheng Biotechが開発したデュアル抗体ホットスタートTaq酵素は、Taq酵素の5'→3'ポリメラーゼ活性を密封するだけでなく、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性も同時に密封します。このデュアルアプローチは、ミスペアリングやプライマーダイマーによる非特異的増幅を効果的に防止し、プローブやプライマーの劣化による非特異的シグナルの発生も防止し、試薬の安定性を二重に高めます。
4、ユニバーサル高性能ワンチューブqPCRマスターミックス
- 優れた汎用性：複数の種類のプライマーとプローブに適しており（40種類以上のターゲットが検証済み）、優れた増幅性能を備えています。
- l スーパーフルプレミックス安定性： 37℃で14日間、4℃で28日間安定、凍結融解を50回繰り返しても安定。
- 高感度と優れた特異性：感度は0.25コピー/μLを検出でき、48穴の特異性には負のピークがありません。
- 高速プログラムをサポート:高速プログラムと互換性があり、30 分で結果が得られます。
- dUP/UDG 汚染防止システム:エアロゾル汚染を効果的に防止するために dUTP/UDG 汚染防止システムを導入しました。
- マルチプラットフォームおよびマルチシステム アプリケーション: Bio-Rad CFX96、ABI Q5、7500、Slan、Tianlong など。
図5：オールインワンプレミックス試薬の安定性研究に基づき、16710ESを3つの異なる方法（4°C、37°C、凍結融解サイクル）で処理しました。実験グループはそれぞれ4°Cと37°Cで7日間処理され、50回の凍結融解サイクルを受けました。一方、コントロールグループ（-20°Cで保管）は4つのマルチプレックス増幅システム（グループ1、2、4は4重増幅システム、グループ3は3重増幅システム）下での安定性を評価しました。結果は、実験グループとコントロールグループ間のCt値の偏差（ΔCt）が±0.5以内、蛍光値の偏差が15％以内であることを示し、
5、ユニバーサル高性能RT-qPCRマスターミックス
ワンステップ RT-qPCR 試薬は、逆転写酵素とホットスタート酵素の優れた性能を統合し、最適化されたバッファリング システムによって補完され、1 桁のコピー テンプレートの迅速かつ高感度な検出を可能にします。呼吸器疾患、動物疫病、研究システムなど、さまざまな顧客市場で検証されているこれらの試薬は、さまざまなアプリケーション方向のニーズを満たすことができます。
- 優れた汎用性：病原微生物、ヒトゲノム、植物、その他の種の核酸のqPCR増幅および検出に適しています。
- 高感度：慎重に最適化されたバッファーシステムにより、最大 250 コピー/mL の低濃度テンプレートの検出感度が向上します。
- dUP/UDG 汚染防止システム：dUTP/熱不安定性 UDG 汚染防止システムを導入し、製品のエアロゾル汚染を効率的に分解し、偽陽性を減らし、正確な結果を保証します。
- 高速プログラムをサポート:高速プログラムと互換性があり、40 分で結果が得られます。
- 優れた安定性： 37℃で14日間安定、凍結融解を10回繰り返しても安定。
検出感度評価
図 6:
製品の推奨
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製品タイプ |
製品名称 |
货号 |
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PCR酵素シリーズ |
Hieff UNICON® ホットスタート E-Taq DNA ポリメラーゼ、5 U/μL |
10726ES |
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Hifair® V 逆転写酵素(200 U/μL) |
11300ES |
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ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG/UNG)、熱不安定、1 U/μL |
10303ES |
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マウスRNase阻害剤(40 U/µL) |
10603ES |
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dNTPミックス（各25mM） |
10125ES |
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極めて低い宿主残留物を備えた超クリーンPCRシングル酵素シリーズ |
Hieff UCF.ME® ホットスタートセンシティブ Taq DNA ポリメラーゼ (5 U/μL) |
14314ES |
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Hifair UCF.ME® V 逆転写酵素 (200 U/μL) |
14608ES |
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UCF.ME® ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG/UNG)、熱不安定、1 U/μL |
14466ES |
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UCF.ME® マウス RNase 阻害剤 (40 U/µL) |
14672ES |
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Lyo-Ready PCRモノ酵素シリーズ |
Hieff UNICON® HotStart E-Taq DNAポリメラーゼ、グリセロールフリー (5U/μL) |
14316ES |
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Hifair® V 逆転写酵素、グリセロールフリー(600 U/μL) |
11301ES |
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ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG)、熱不安定 (1 U/μL、グリセロールフリー) |
10707ES |
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マウスRNase阻害剤（200 U/µL、グリセロールフリー） |
10703ES |
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RT-qPCR マスターミックス |
Hifair® C203P1 マルチプレックス ワンステップ RT-qPCR プローブキット（UDG Plus） |
16630ES |
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Hifair® V マルチプレックス ワンステップ RT-qPCR プローブキット（UDG Plus） |
11899ES |
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Hifair® Lyo マルチプレックス ワンステップ RT-qPCR キット |
11831ES |
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qPCR マスターミックス |
Hieff Unicon® ユニバーサル TaqMan Pro U+ qPCR ミックス（1 チューブ） |
16710ES |
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Hieff Unicon® ユニバーサル TaqMan マルチプレックス qPCR マスターミックス（UDG plus） |
13891ES |
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Hieff Unicon® Superpro Ⅰ TaqMan qPCR マスターミックス（UDG plus） |
11827ES |
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Hieff Unicon® Purepro Ⅰ TaqMan qPCR マスターミックス（UDG plus） |
11853ES |
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Hieff Unicon® ユニバーサル TaqMan マルチプレックス qPCR マスターミックス（UDG plus） |
11893ES |