医学研究が進歩するにつれ、標的療法はより成熟してきました。標的療法の前提は、薬剤の分子標的に対して遺伝子検査を行い、遺伝性疾患や悪性腫瘍を引き起こす遺伝子変異を特定することです。ARMS-PCR は、多数の DNA 点変異を検出できる PCR に基づく新しい方法です。現在、これは癌のカスタマイズされた遺伝子識別のための最も重要かつ広く普及している方法の 1 つです。その治療的使用の利点は、現場の専門家によって十分に認識されています。

1. 対立遺伝子特異的PCRはどのように機能しますか?
2. ARMS の特異性を向上させるにはどうすればよいでしょうか?
3. Yeasen が提供する製品の特徴は何ですか?
4. 製品パフォーマンスデータとは何ですか?
5. 商品はどうやって注文するのですか?

1. 対立遺伝子特異的PCRはどのように機能しますか?

ARMS-PCR は増幅難治性変異システム PCR (ARMS-PCR) であり、対立遺伝子特異的 PCR (AS-PCR) とも呼ばれます。対立遺伝子特異的伸長を制御して野生型対立遺伝子と変異野生型遺伝子を識別し、Taqman プローブ技術を使用して蛍光シグナル値を測定します。
ARMS PCR プライマーは、対立遺伝子の 2 つの上流プライマーの 3' 末端に異なるヌクレオチドを持つように設計されており、2 つのプライマーはそれぞれ野生型と変異型に特異的です。増幅中、テンプレートに完全に一致しない上流プライマーは相補的な塩基対を形成できず、ミスマッチ、伸長の妨害、PCR 産物の生成不能が生じますが、テンプレートに一致するプライマー システムは対応する PCR 産物を増幅できます。Taqman プローブの蛍光体は、デバイスで検出できる蛍光信号を発し、蛍光データを評価することで遺伝子型を検証できます。
ARMS技術は感度が高く、検出限界は100コピー/ mLに達し、腫瘍組織の検出限界は0.5％の変異率に達します。また、ARMSは時間がかかり、コストが低く、結果は直感的で判断しやすいです。これは、qPCRまたは電気泳動技術と組み合わせたARMSではPCR反応が1回だけ必要で、時間がかからないためです。ARMS技術では、上流プライマーのみを最適化する必要があり、MGBプローブを使用したリアルタイムPCR技術と比較して、コストが低く、直感的な結果が得られます。パラフィン包埋組織標本から抽出されたDNAのほとんどは断片化されているため、正確な検出結果を得ることができません。ARMS法は、対象製品の長さを最小限に抑えるように設計されており、パラフィン包埋組織におけるこの困難に対処しています。同時に、PCRプラットフォームと組み合わせたARMSは、操作が簡単で製品の後処理が不要な閉管操作を実現し、増幅製品の汚染を最大限に回避します。
理論的には、Taq DNA ポリメラーゼは、効率的な重合を行うために、プライマーの 3' 末端に残っているテンプレートと完全に相補的でなければなりません。しかし、Taq DNA のストリンジェンシーはいくつかの要因の影響を受けます。場合によっては、プライマーの 3' 末端塩基がテンプレートと相補的でなくても、伸長が進行することがあります。3' 末端に 1 つの塩基のミスマッチしかない場合、プライマーはミスマッチして伸長できますが、伸長効率は低くなります。3' 末端の転位が異なると、伸長効率も異なります。3' 末端に他のミスマッチ塩基が導入されると、ミスマッチの数が多すぎて、3' 末端は特定のレベルを超えると伸長できなくなります。そのため、プライマーの 3' 末端に 1 つの塩基のミスマッチがあるだけでは、2 つの対立遺伝子を適切に区別できず、偽陽性の結果になります。

2. ARMS の特異性を向上させるにはどうすればよいでしょうか?

ARMS 特異性の向上の焦点は、プライマー伸長特異性の向上です。ミスマッチ塩基は、3' 末端から 2 塩基目または 3 塩基目に導入される可能性があります。ミスマッチ塩基は、3' 末端のミスマッチ塩基と一緒に作用し、3' 末端に相補的でないテンプレートでは、プライマー増幅産物率が低下します。プライマーは、3' 末端に相補的なテンプレートでは正常に増幅しますが、プライマーのミスマッチ塩基の種類は、3' 末端の塩基ミスマッチの種類によって異なります。
ARMS 用の特異的プライマーを設計した後、対立遺伝子特異的蛍光共鳴エネルギー移動用の TaqMan プローブのペアが必要です。TaqMan プローブには 2 つの蛍光色素があり、5' 末端は蛍光遺伝子、3' 末端には一般的な蛍光消光遺伝子があります。完全なプローブでは、消光遺伝子と蛍光発生遺伝子が空間的に非常に接近しているため、蛍光消光が発生します。通常の状況では、5' 末端の蛍光体が発する蛍光は検出できず、3' 末端の消光剤の背景蛍光のみを検出できます。ターゲット遺伝子増幅のプロセスでは、PCR プライマーと蛍光標識プローブの両方が、de-OR 中にターゲット配列と相補的になります。Taq 酵素がテンプレート鎖を伸長するときにテンプレートに安定して結合したプローブに遭遇すると、Taq 酵素の 5'-3' エキソヌクレアーゼがテンプレートに結合した特定のプローブを分解します。プローブ上の蛍光体が物理的空間によって分離され、消光効果が消えて蛍光が放出されます。弱い蛍光プローブとターゲット配列の間に不一致があると、放出される蛍光の量が減少します。

図1 ARMS-PCRの基本概念

3. Yeasen が提供する製品の特徴は何ですか?

YEASEN Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix は、効率的な ARMS-PCR を介したジェノタイピングを可能にする増幅ブロック コンセプトに基づいたキットです。

👍高い選択性：複数の遺伝子変異を識別できます。
👍高感度: 変異プライマーは、10ng/L DNA 中の 0.5% という低濃度でも変異を検出できます。
👍読みやすい：結果は明白で客観的に評価されており、わかりやすく複雑ではありません。
👍操作が簡単: さまざまな PCR 機器と互換性があり、操作モードが標準化されており、オンボード検出は 90 分で完了します。

4. 製品パフォーマンスデータとは何ですか?

4.1 優れた製品閉塞効果

実験: 5Lのテンプレート入力、10ng/Lの野生型テンプレート、および同等量の変異プラスミドを変異プライマーを使用して増幅した。
場所：KRASG13D（38G>A）
赤：13755；青：競合他社

図 2 は、野生型プライマーが野生型と変異型テンプレートの両方を増幅することを示しています。増幅曲線によると、野生型テンプレートにはピークがないか、野生型と変異型の Ct 値の差が 6 ～ 8 であるため、野生型遺伝子と変異型遺伝子を効果的に区別できます。

4.2 製品検出率は0.05％に達する可能性がある

実験 1: 自己混合標準調製法 (50%): 50μL 10ng/μL 野生型 DNA と 50μL 3X103 コピーの変異プラスミド。
場所：KRASG13D(38G>A)

図3.増幅曲線によれば、製品は0.05%の濃度でも効果的に作用し続ける。

実験 2: 購入した 5% 標準 (50 ng/μL) をライブラリ希釈液で 10 ng/μL に希釈し、さらに 10 ng/μL 293g DNA で 0.1 % と 0.05 % に希釈しました。
場所：L858R
赤：13755；青：競合他社

図 4: 増幅曲線によると、10 ng/μL の野生型 gDNA バックグラウンドに対する遺伝子座の検出率は 0.05% にも達し、その後の商用基準による検証により、当社製品の検出率が優れていることが実証されています。

4.3 優れた製品安定性

製品の増幅効果と遮断効果は、10 回の凍結と解凍によって影響を受けません。
実験：赤：-20℃、緑：本物の凍結融解5回、青：本物の凍結融解8回、紫：本物の凍結融解10回。
場所：L858R

図 5 は、試薬 13755 を 10 回繰り返し凍結および解凍しても、その増幅およびブロッキング特性に影響がないことを示しています。

増幅効果と遮断効果は 37 °C で 7 日間影響を受けません。
実験: 赤: -20°C、緑と紫: 37°C、7日間。
場所：L858R

図 6 は、37°C​​ で 7 日間処理しても、13755 試薬の増幅およびブロッキング作用に影響がないことを示しています。

5. 商品はどうやって注文するのですか?

2014年に設立されたYeasen Biotechnology（上海）Co., Ltd.は、ツール酵素原料と抗原抗体の研究開発と生産に従事するハイテク企業です。その製品には、医薬品、食品安全検査、育種、司法などの業界で使用される分子診断酵素、タンパク質、抗体が含まれます。私たちは、生命科学分野の顧客に高品質の製品とサービスを提供することに尽力しています。Yeasenが提供できる製品は次のとおりです。

表1: Yeasenが提供する製品