説明
T7 高収率 RNA 合成キットは、転写反応システムを最適化します。このキットは、T7 RNA ポリメラーゼ、T7 プロモーター配列をテンプレートとする線状二本鎖 DNA、プロモーター下流の DNA 配列を制御する基質としての NTP を使用して、一本鎖 RNA を効率的に合成できます。転写中に、修飾ヌクレオチドを基質に加えて、ビオチンまたは色素標識 RNA を調製できます。
このキットは長い転写産物と短い転写産物を合成することができ、1 μg の DNA テンプレート入力で 100 ～ 200 μg の RNA を生成できます。転写によって合成された RNA は、RNA の構造と機能の研究、RNase 保護、プローブのハイブリダイゼーション、RNAi、マイクロインジェクション、in vitro 翻訳など、さまざまな下流アプリケーションに使用できます。
図1: 試験管内RNA転写プロセス
特徴
- 1μgのコントロールテンプレートから反応あたり最大180μgのRNA
- IVTプロセスに最適化された反応システム
- dsRNAの産生を減らす
- RNAの完全性と純度の向上
応用
- 試験管内RNA合成
コンポーネント
| コンポーネント番号 | 名前 | 10623ES50 (50T) | 10623ES60（100T） | 10623ES70（500T） |
| 10623-A | T7 RNAポリメラーゼミックス | 100μL | 200μL | 1mL |
| 10623-B | 10×転写バッファー | 100μL | 200μL | 1mL |
| 10623-C | ATP（100mM） | 100μL | 200μL | 1mL |
| 10623-D | CTP（100mM） | 100μL | 200μL | 1mL |
| 10623-E | GTP（100mM） | 100μL | 200μL | 1mL |
| 10623-F | UTP（100mM） | 100μL | 200μL | 1mL |
| 10623-G | コントロール DNA テンプレート (500ng/μL) | 10μL | 20μL | 100μL |
配送と保管
ドライアイス輸送。-15℃～-25℃で保管、2年間有効。
数字
図 1. 標準 RNA は、T7 RNA 合成キットを使用して in vitro で合成されました。
反応はPCR装置で37℃で2時間インキュベートされ、その後磁気ビーズ（カタログ番号12602）で精製されました。収量結果は、図1に示すようにNanoDrop分光光度計で分析されました。
図2. T7キットによる異なる長さのRNAの転写の実証。それぞれ電気泳動図（図2A）、キャピラリー電気泳動図（図2B）、クロマトグラム（図2C）で示されています。
図 3. キャップされた RNA の in vitro 合成。
反応物はPCR装置で37℃で2時間インキュベートされ、その後磁気ビーズ（カタログ番号12602）で精製されました。収量結果は、図3Aに示すようにNanoDrop分光光度計で分析されました。完全性の結果は、図3Bに示すようにキャピラリー電気泳動で分析されました。
1. 転写産物の収量が低い
テンプレートの品質は収量と密接に関係しています。実験グループの収量が対照グループよりも大幅に低い場合、考えられる理由は次のとおりです。
①実験テンプレートに阻害成分が含まれている；
② テンプレートに問題があります。
提案:
① テンプレートを再精製する。
② テンプレートの定量化とその完全性を決定する。
③ 反応時間を延長する
④ テンプレート入力量を増やす
⑤ 他のプロモーターとRNAポリメラーゼを試してください。
2. 短いトランスクリプトの収量が低い
短い転写開始フラグメントは反応を阻害します。転写産物が 100 nt 未満の場合、反応時間を 4 ～ 8 時間に延長するか、テンプレートの量を 2 μg に増やすと、RNA 収量が増加します。
3. RNA転写の長さが予想よりも長い
電気泳動の結果、生成物のバンドが予想サイズよりも大きいことが判明した場合、考えられる理由は次のとおりです。
①プラスミドテンプレートが完全に直線化されていない可能性があります。
②センス鎖の3'末端は目立つ構造を有する。
③RNAは完全に変性していない二次構造を持っています。
提案:
①テンプレートが完全に線形化されているかどうかを確認し、必要に応じて追加の線形化を実行します。
②3'オーバーハングを避けるために適切な制限酵素を選択するか、Klenow Fragment /T4 DNAポリメラーゼを使用して転写を完了してから続行します。
③変性ゲルを使用してRNA産物を検出します。
4. RNA転写の長さが予想より短い
電気泳動の結果、生成物のバンドが予想サイズよりも小さいことが判明した場合、考えられる理由は次のとおりです。
①テンプレートにはT7 RNAポリメラーゼに類似した終結配列が含まれています。
②テンプレート中のGC含有量が高い。
提案:
①反応温度を下げる（例えば30℃）。温度を下げると転写の長さが長くなることもありますが、収量は減ります。または、転写に別のRNAポリメラーゼを試してください。
②テンプレートのGC含量が高い場合は、42℃で転写するか、SSBを添加して収量と転写長を増加させます。
5. 転写産物の電気泳動テーリング
電気泳動中にテーリング現象が発生します。
考えられる理由:
①実験操作中にRNaseに汚染された
②RNaseによるDNAテンプレートの汚染。
提案:
①RNaseフリーのピペットチップとEPチューブを使用し、使い捨てのラテックス手袋とマスクを着用し、すべての試薬はRNaseフリーH2Oで調製します。
②テンプレートDNAを再精製する。
[1] Dong Z、Zheng N、Hu C、et al。Nosema bombycis microRNA-like RNA 8（Nb-milR8）は、宿主であるBombyx moriにおけるBmPEX16遺伝子発現を調節することにより真菌病原性を増加させる。Microbiol Spectr。2021;9(2):e0104821。doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)
[2] Wang X、Tang S、Ye S、et al. 三本鎖置換増幅カスケードによる循環 miR-195-5p の超高感度定量。Talanta。2022;242:123300。doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)
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