Hoe een uitstekend glycerolvrij moleculair enzym ? te produceren

Moleculaire diagnostische technologie onderscheidt zich van verschillende detectiemethoden door zijn uitzonderlijke gevoeligheid en specificiteit. Conventionele vloeibare diagnostische reagentia hebben echter nadelen zoals hoge transportkosten en een beperkte houdbaarheid, wat hun bruikbaarheid beperkt. Als reactie op de veranderende marktbehoeften en technologische vooruitgang zijn er gelyofiliseerde moleculaire diagnostische testreagentia ontstaan. Gevriesdroogde producten bieden verschillende voordelen ten opzichte van traditionele vloeibare testreagentia, waaronder:

• Stabiel bij kamertemperatuur - de driedimensionale structuur is vast, wat de stabiliteit van het enzym en het reactiesysteem bij kamertemperatuur kan garanderen. Geen behoefte aan koudeketentransport en opslag in koelkasten of koude opslag, wat de houdbaarheid van producten kan verlengen.
• Gemakkelijk te gebruiken- Geen herhaaldelijk invriezen en ontdooien, afgeven van vloeistoffen, enz. nodig.
• Lagere kosten- Geen behoefte aan koelketentransport en diepvriesopslag, waardoor de transport- en opslagkosten effectief worden verlaagd.
• Hoge precisie- Eén gevriesdroogde microkern wordt in één reactie gebruikt om de samenstellingsfout tijdens de bereiding van reagentia te verminderen, de bewerkingstijd te verkorten, het verlies van biologische activiteit tijdens de vloeistofbereiding te voorkomen en de precisie fundamenteel te verbeteren.
• Flexibel gebruik- Niet beperkt tot het aantal monsters, er kan ook één monster worden geladen.

Conventionele moleculaire enzymen of premixen bevatten vaak hoge concentraties glycerine als cryoprotectief middel en stabilisator. De aanwezigheid van glycerine in het reagens kan echter de structurele integriteit van het water verstoren, waardoor het lastig wordt om water effectief te verwijderen. Dit heeft op zijn beurt een nadelige invloed op de structuur en stabiliteit van het gevriesdroogde product. Daarom is het raadzaam om bij het kiezen voor vriesdrogen glycerolvrije reagentia te selecteren.

Bovendien kan in toepassingen die bijzonder gevoelig zijn voor reagenssamenstelling, zoals digitale PCR, het gebruik van glycerinevrije enzymen met een hoge concentratie de invloed van glycerol op de digitale PCR-reactie verder verminderen. Deze aanpak minimaliseert niet alleen interferentie, maar vergroot ook het potentieel voor het optimaliseren van het digitale PCR-detectiereagenssysteem.

Yeasen Glycerolvrij moleculaire enzymoplossing

Yeasen heeft een uitgebreid R&D- en productieplatform voor niet-glycerine moleculaire enzymen opgezet en heeft grootschalige productie van meerdere glycerolvrije moleculaire enzymen bereikt door middel van materiaalselectie, omgevingscontrole, procesoptimalisatie en kwaliteitsborging.

• Proef van het dialyseproces

Optimaliseren van het dialyseproces voor een vast volume glycerine-enzym:

1. Screening naar de optimale dialysebuffer voor verschillende moleculaire enzymen;
2. Screening naar stabiele opslagoplossingen voor verschillende moleculaire enzymen om langdurige opslag bij 4℃ of -20℃ mogelijk te maken.

• Versterking van het tangentiële stromingsfiltratieproces

Op basis van de dialyseprocesscreening kunnen de optimale dialysebuffercomponenten en hun optimale opslagoplossingen worden bepaald. Vervolgens kan het tangentiële flowfiltratieproces (ook bekend als UFDF) worden gebruikt voor het vervangen van de oplossingbuffer.

De cruciale factoren bij de ontwikkeling van het tangentiële stromingsfiltratieproces hebben betrekking op de keuze van de formule voor de opslagoplossing, de formule voor de was- en filtratieoplossing, evenals de transmembraandruk en de stroomsnelheid die tijdens de filtratie worden toegepast. Yeasen heeft een gestandaardiseerde aanpak voor tangentiële flowfiltratie ontwikkeld, waarmee de snelle bepaling van was- en filtratievolumes en tijdsparameters mogelijk is op basis van het gewenste glycerinegehalte in het doelmoleculaire enzym. Deze aanpak helpt bij het besparen op zowel materialen als tijd.

• Kwaliteitscontrole

De verschillende hierboven beschreven voorbereidingsprocessen zijn ontworpen om tegemoet te komen aan de uiteenlopende vereisten voor verschillende volumes en producttypen. Om de productstabiliteit in verschillende batches en binnen hetzelfde proces te beoordelen, Yeasen heeft een uitgebreid systeem voor prestatieparameterkarakterisering ontwikkeld. Dit systeem maakt een grondige evaluatie van de impact van glycerolvrije maatregelen vanuit meerdere perspectieven mogelijk. Karakteriseringsmethoden omvatten onder andere eiwitkwantificering, enzymactiviteitsbeoordeling (herstelpercentage), analyse van glycerinegehalte, beoordeling van beschermende agentiagehalte en evaluatie van enzymprestaties.

Yeasen glycerolvrije moleculaire enzymproducten

Yeasen heeft een glycerolvrije moleculaire enzymbereidingsmethode aangenomen om enzymen te produceren zonder glycerinegehalte uit enzymen die oorspronkelijk glycerine bevatten. Momenteel kunnen we aanzienlijke hoeveelheden glycerolvrije enzymgrondstoffen leveren die geschikt zijn voor qPCR/RT-qPCR- en LAMP/RT-LAMP-toepassingen. Deze grondstoffen zijn ontworpen voor vriesdrogen in diagnostische tests, terwijl ze hetzelfde kwaliteitsniveau en dezelfde prestaties behouden als hun vloeibare tegenhangers.

Glycerolvrije moleculaire enzymproducten

qPCR-premixen werden bereid met behulp van Yeasen 14316ES E-Taq DNA-polymerase en overeenkomstige glycerolvrije enzymen, respectievelijk, en de template van 10⁵, 10⁴ en 10³ kopieën/ml werden tegelijkertijd versterkt. De resultaten toonden aan dat het versterkingseffect van glycerolvrije 14316ES consistent was met dat van glycerinebevattende tegenhanger. De versnelde stabiliteitstest van 14316ES werd uitgevoerd bij 37℃. De resultaten toonden aan dat de expansieprestatie van 14316ES consistent was met die van niet-versnelde controle na 54 dagen versnelde behandeling bij 37℃. De bovenstaande resultaten toonden aan dat er geen verschil was in de prestatie van glycerolvrij enzym en glycerinebevattende tegenhanger, en de stabiliteit was goed.

• RT-qPCR-vriesdroogproducten: Versneld bij 50℃ gedurende 25 dagen, hebben vriesdroogproducten een stabiele morfologie en prestatie

Yeasen 14316ES werd bereid in een RT-qPCR-voorgemengde oplossing, die werd gevriesdroogd en getest op versnelde stabiliteit bij 50℃ gedurende 25 dagen. Tegelijkertijd werden 10⁵, 10⁴ en 10³ kopieën/ml van het nieuwe coronavirus pseudovirus-sjabloon werden versterkt.Uit de resultaten bleek dat de productmorfologie, de Ct-waarde en de fluorescentiewaarde geen significante verandering vertoonden voor en na het vriesdrogen en dat het vriesdroogproduct een goede stabiliteit had.

• RT-LAMP gevriesdroogde producten: Versneld bij 45℃ gedurende 30 dagen, gevriesdroogde producten hebben een stabiele morfologie en prestatie

De RT-LAMP-premix werd bereid met Yeasen 14405ES en 11297ES, en de prestatietest werd uitgevoerd na vriesdrogen. Het positieve reactiegat was oranje en het negatieve reactiegat was magenta, wat een groot contrast liet zien, en het resultaat werd duidelijk geïnterpreteerd. Bovendien veranderde de morfologie van gevriesdroogde producten niet significant na 30 dagen acceleratie bij 45℃. De resultaten toonden aan dat het gevriesdroogde product stabiel was in vorm en prestatie.

Productinformatie

Classificatie	Nik ben	Catalogusnr.
Glycerolvrije enzymproducten voor qPCR/RT-qPCR	Hifair™ Lyo Multiplex One Step RT-qPCR-kit -11831ES	11831ES
	Hieff UNICON® HotStart E-Taq DNA-polymerase, glycerolvrij	14316ES
	Hifair® V Reverse Transcriptase, Glycero-vrij	11301ES
	Uracil DNA Glycosylase (UDG), Glycerol-vrij	10707ES
	Muizen-RNase-remmer (200 U/μL, glycerolvrij)	10703ES
Glycerolvrije enzymproducten voor RT-LAMP	Hifair® III Reverse Transcriptase, 600U/μl, Glycerolvrij	11297ES
	Gevriesdroogde Bst Plus DNA-polymerase (60 U/μL, glycerolvrij)	14405ES