1.Förord
Makrofager är stora fagocyter som är differentierade från monocyter i blodet. De finns i nästan alla vävnader, särskilt de som är i frekvent kontakt med omvärlden som hud, lungor och tarmar. Makrofager spelar en viktig roll i många biologiska processer såsom mänskligt immunförsvar, inflammatoriskt svar, vävnadsreparation, immunreglering och sjukdomsutveckling.
Primära humana makrofager är svåra att isolera från vävnader i tillräckligt antal och förökar sig inte i kultur. Monocythärledda makrofager utgör ett utmärkt alternativ eftersom monocyter i humant blod lätt erhålls i stora mängder och kan differentieras till makrofager in vitro.
2. Biologiska funktioner av makrofager
- Fagocytos
Makrofager känner igen och uppslukar patogener och skräp från döda celler genom receptorer på deras yta. Denna process hjälper inte bara till att rensa infektion, utan förhindrar också att dessa ämnen ansamlas i kroppen, vilket kan orsaka inflammation eller andra problem.
- Anti-patogen försvar
Makrofager bekämpar patogener genom att producera kemikalier som dödar mikroorganismer, såsom reaktivt syre och kväveoxider, samt cytokiner och kemokiner som reglerar inflammatoriska svar.
- Inflammationsreglering
Makrofager spelar en komplex roll i inflammatoriska svar. De kan inte bara främja inflammation genom att frisätta pro-inflammatoriska cytokiner som tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) och interleukin 1 (IL-1), utan även hämma inflammation genom att producera antiinflammatoriska cytokiner som IL-10 och TGF-β.
- Vävnadsreparation och rekonstruktion
Efter ett inflammatoriskt svar hjälper makrofager till att reparera och regenerera vävnader genom att utsöndra olika tillväxtfaktorer. De rensar resterna av skador samtidigt som de främjar bildandet av nya vävnader.
- Immunmodulering
Makrofager främjar specifika immunsvar genom att presentera antigener för T-celler. Samtidigt reglerar de andra komponenter i immunsystemet genom att utsöndra olika cytokiner, som att reglera aktiviteten hos T-celler och B-celler.
- Samband med sjukdomar
Makrofager spelar en viktig roll i utvecklingen av många sjukdomar, inklusive infektionssjukdomar, autoimmuna sjukdomar, tumörer och kroniska inflammatoriska sjukdomar som ateroskleros.
3. Klassificering av makrofager
Beroende på deras aktiveringstillstånd och funktion kan makrofager delas in i två huvudkategorier: M1 och M2. Dessa två undertyper spelar olika roller i immunsvar och inflammationsreglering.
M1 makrofager
M1-makrofager stimuleras huvudsakligen av cytokiner såsom interferon gamma (IFN-y) och tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α), och har pro-inflammatoriska egenskaper. De har stark antimikrobiell aktivitet, kan producera fria syreradikaler och inflammatoriska faktorer och deltar i att döda och rensa patogena mikroorganismer som bakterier och virus.
M1-makrofager deltar i kroppens immunförsvar och inflammatoriska svar, främjar infiltrationen av inflammatoriska och immunceller, hjälper till att rensa infekterade och skadade vävnader och främjar förekomsten och underhållet av immuninflammatoriska svar.
M2 makrofager
M2-makrofager stimuleras huvudsakligen av cytokiner såsom interleukin-4 (IL-4) och interleukin-13 (IL-13), och har antiinflammatoriska och reparationsegenskaper. De deltar i vävnadsreparations- och regenereringsprocesser, främjar antiinflammatoriska svar och immunreglering.
M2-makrofager spelar en viktig roll i det sena stadiet av inflammation och vävnadsreparation, främjar upplösningen av inflammation och vävnadsreparation, reglerar balansen mellan immunsvar och främjar vävnadsregenerering och reparation.
Figur 1. Sammanfattning av de huvudsakliga makrofagpolarisationstillstånden för aktiverade makrofager [1]
4. Isolering, odling och differentiering av makrofager in vitro
4.1 Separationsmetod
- Isolering från perifert blod
Isolering av monocyter: Perifera mononukleära blodceller (PBMC) isoleras med densitetsgradientcentrifugering (t.ex. Ficoll-Paque). Blodprovet läggs till det övre lagret av Ficoll, och efter centrifugering placeras monocyterna mellan plasma- och Ficoll-lagren.
Isolering av makrofager: Efter att monocyterna har isolerats från PBMCs kan de mononukleära prekursorcellerna isoleras ytterligare genom plastisk vidhäftning. Monocyter odlas i plastodlingsskålar i flera timmar, icke-vidhäftande celler avlägsnas och de återstående vidhäftande cellerna är huvudsakligen mononukleära prekursorceller.
- Isolering från vävnader
Vävnadsprover bryts ner till encellssuspensioner genom mekanisk och/eller enzymatisk behandling (t.ex. kollagenas och DNas). Icke-målceller avlägsnas genom densitetsgradientcentrifugering eller negativ selektion (med användning av antikroppar och magnetiska pärlor) och makrofager samlas in.
4.2 Kulturmetod
Vanligt använda odlingsmedier inkluderar RPMI 1640 eller IMDM, som vanligtvis behöver kompletteras med 10 % fetalt bovint serum (FBS), 1 % penicillin/streptomycin och nödvändiga tillväxtfaktorer. Odlingsförhållandena är vanligtvis i en inkubator vid 37°C och 5% CO2
4.3 Differentieringsinduktionsmetod
- Differentiering från mononukleära prekursorceller
Använder M-CSF: Tillsätt makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) till odlingsmediet, vanligtvis i en koncentration av 20-50 ng/ml, och fortsätt odlingen i 7-10 dagar för att inducera differentieringen av mononukleära prekursorceller till makrofager.
Använda GM-CSF: Granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) kan också inducera differentieringen av makrofager, särskilt tendensen att producera M1 (pro-inflammatoriska) makrofager.
- Ytterligare reglering av fenotyp och funktion
M1 makrofager: kan induceras genom att tillsätta IFN-y (interferon-y) och LPS (lipopolysackarid) till odlingsmediet.
M2 makrofager: kan induceras genom tillsats av antiinflammatoriska cytokiner såsom IL-4 och IL-13.
Dessa metoder gör det möjligt för forskare att studera makrofagernas olika biologiska funktioner och deras beteende under patologiska förhållanden in vitro. De specifika driftsförhållandena för varje steg (såsom celldensitet, odlingstid, koncentration av tillsatta faktorer, etc.) kan behöva optimeras enligt experimentets specifika syfte.
Tabell 1.Makrofagkultur och induktionsförhållanden
| Cellkälla | Kulturmedium | Inledande tillägg | M1 polarisering | M2 polarisering |
| THP-1-cell | RPMI 1640 | 100 ng/ml PMA | 20 ng/ml IFN-y 100 ng/ml LPS | 20 ng/ml IL-4 20 ng/ml IL-13 |
| Monocyter | RPMI 1640 | M1:50 ng/ml GM-CSF M2: 50 ng/ml M-CSF | 10 ng/ml LPS 50 ng/ml IFN-y | M2a: 20 ng/ml IL-4 M2b: IgG+LPS M2c: 20 ng/ml TGF-β1 eller 10 ng/ml IL-10 |
| Mpil | IMDM | 10-50 ng/ml M-CSF | 100 ng/ml LPS (50ng/ml IFN-y kan tillsättas) | 10 ng/ml IL-4 (10 ng/ml IL-13 kan tillsättas) |
| RAW264.7 Cell | DMEM | / | 100 ng/ml LPS | 20 ng/ml IL-4 (20 ng/ml IL-10 kan tillsättas） |
5. Analysdata
YEASEN tillhandahåller en serie HiActive® högaktiva cytokinprodukter relaterade till makrofagkultur för att stödja makrofagforskning.
HiActive® högaktiva cytokiner:Den biologiska aktiviteten för varje cytokin har verifierats för att säkerställa den höga aktiviteten hos cytokinen.
Aktivitetsverifieringsdata:
Rekombinant mus M-CSF-protein
Figur 1. Uppmätt i en cellproliferationsanalys med M-NFS-60-mus myelogen leukemi lymfoblastceller. ED50 för denna effekt är typiskt 16,74 -25,83 ng/ml.
Rekombinant Mus GM-CSF Protein
Figur 2. ED50 bestämt genom en cellproliferationsanalys med användning av murina FDC-P1-celler är 2,79-12,84 pg/ml.
Rekombinant Humant IL-10 Protein
Figur 3. ED50 bestämt genom en cellproliferationsanalys med användning av murina MC/9-celler är mindre än 0,1 ng/ml, vilket motsvarar en specifik aktivitet på > 1,0×107 IE/mg.
Relaterade produkter
| Klassificering | Art | Katt | Specifikation |
| G-CSF | Mänsklig | 2 μg/10 μg/ 50 μg/ 100 μg | |
| Mus | 2 μg/ 10 μg/50 μg/100 μg/500 μg | ||
|
M-CSF | Mänsklig | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Mus | 10 μg/100 μg/ 500 μg | ||
|
GM-CSF | Mänsklig | 5 μg/50 μg/100 μg/ 500 μg | |
| Mus | 10 μg/100 μg/ 500 μg | ||
| IFN-y | Mänsklig | 20 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Mus | 5 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-4 | Mänsklig | 5 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Mus | 5 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-10 | Mänsklig | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Mus | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-13 | Mänsklig | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Mus | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg |
Referenser
[1]Atri C, Guerfali FZ, Laouini D.Roll av polarisering av mänskliga makrofager i inflammation under infektionssjukdomar. Int J Mol Sci. 2018 juni 19;19(6):1801.