Med utvecklingen av stamcellsterapi och organoidbaserad läkemedelsutveckling spelar basalmembranmatris en avgörande roll som närings- och stödbärare för stamcellskulturer och organoider, 3D-cellkulturer och andra applikationer inklusive angiogenes, in vivo tumörbildningsexperiment, etc. Ceturegel™ basalmembranextrakt extraheras från Engelbreth tumörextrakt (EHSwarm) i extracellulära matrisproteiner inklusive laminin, typ IV kollagen, nestin, etc. IGF, FGF och andra tillväxtfaktorer. Vid rumstemperatur polymeriserar Ceturegel™ basalmembranmatrisen för att bilda en biologiskt aktiv tredimensionell matris. Det kan simulera strukturen, sammansättningen, fysikaliska egenskaperna och funktionerna hos cellbasalmembranet in vivo, vilket är fördelaktigt för odling och differentiering av celler in vitro och är ett bra matrigelalternativ.

1. Vad är Ceturegel™ basalmembranmatris?
2. Vilken roll har Ceturegel™ basalmembranmatris?
3. Vilka egenskaper har Ceturegel™ basalmembranmatris?
4. Den populära applikationen av Ceturegel™ basalmembranmatris
5. Vanliga frågor
6. Valguiden för Ceturegel™ basalmembranmatris från Yeasen

1. Vad är Ceturegel™ basalmembranmatris?

Matrisen intill endotelceller, epitelceller, muskel- och neuronala celler bildar en kontinuerlig, skiktad extracellulär matris som kallas basalmembranet. Basalmembranet degenererar och regenererar under utveckling och sårläkning. Det stöder inte bara celler och cellskikt utan spelar också en viktig roll i bildandet av vävnader genom att påverka cellvidhäftning, migration, proliferation och differentiering, som är funktioner i basalmembranet. Därför kan man säga att basalmembranet är huvudbarriären mot invasionen av metastaserande tumörceller.

Figur 1. Ceturegel™ basalmembranmatris

Ceturegel™ basalmembranmatrisen utvecklad och producerad av YEASEN innehåller inte LDEV (Lactate Dehydrogenase Enhancing Virus) och har ultralågt endotoxininnehåll. Och efter mykoplasma-detektering för att säkerställa ingen mykoplasmakontamination, inklusive olika typer som baskoncentration, hög koncentration och låg tillväxtfaktor.

2. Vilken roll har Ceturegel™ basalmembranmatris?

Ceturegel™ basalmembranmatris kan användas för att framställa basalmembranmatriser med olika krav. Den kan användas för cellsignaleringsstudier, såsom studiet av tillväxtfaktorernas roll i bildandet av njurtubuli av musnjurstamceller, genuttrycksstudien av musbröstepitelstamceller och tumörinvasivitetsexperimentet av Transwell. Samtidigt kan den användas för att studera cellmorfologi, biokemisk funktion, migration, infektion och genuttryck. Ceturegel™ basalmembranmatris kan effektivt hjälpa till att fästa och differentiera epitelceller och andra typer av celler, inklusive nervceller, stamceller, epitelceller från däggdjur, melanomceller, vaskulära endotelceller, sköldkörtelceller och hårsäcksceller. Samtidigt påverkar Ceturegel™ basalmembranmatris också proteinuttrycksnivån hos murina bröstepitelceller och stöder perifer nervregenerering.

Figur 2.De huvudsakliga appliceringsanvisningarna för Ceturegel™ basalmembranmatris

Cellmigrering och invasion i detalj: Cellmigrering, även känd som cellkrypning, rörelse eller rörelse, hänvisar till rörelsen av celler efter att de fått en migrationssignal eller känner en gradient av vissa ämnen. Cellmigration är en alternerande process av förlängning av pseudopodi i cellhuvudet, etablering av nya adhesioner och tillbakadragning av svansen av cellkroppen. Cellmigrering är en av normala cellers grundläggande funktioner, och det är också en fysiologisk process för normal tillväxt och utveckling av kroppen. Som en allestädes närvarande form av rörelse av levande celler kan den delta i en mängd olika kollektiva fysiologiska och patologiska processer. Såsom embryonal utveckling, angiogenes, sårläkning, immunsvar, inflammatoriskt svar, ateroskleros, cancermetastaser, etc. Medan cellinvasion hänvisar till cellers förmåga att migrera från ett område till ett annat genom den extracellulära matrisen. Cellinvasion är svaret från normala celler och cancerceller på kemiska och mekaniska stimuli. Cellinvasion förekommer ofta i processerna för sårläkning, angiogenes, inflammation, tumörcellsmetastaser och onormal infiltration av vävnader.

3. Vilka egenskaper har Ceturegel™ basalmembranmatris?

Hög säkerhet: inget LDEV (laktatdehydrogenasförhöjt virus)
Koncentrationsmångfald: koncentrationsintervallet är mellan 8~20 mg/ml
Bra batchstabilitet: strikt produktionskvalitetskontroll för att säkerställa stabil prestanda mellan batcherna
Lågt endotoxin: endotoxinhalt <8 EU/ml
Detektering av kontaminering: inga rester av mykoplasma, bakterier och svampar har upptäckts
Hög engångseffekt: enstaka batch-utgång är över 50L-nivån
Kompatibilitet: Kompatibel med alla typer av cellodlingsmedium

4. Den populära applikationen av Ceturegel™ basalmembranmatris

4.1 Migrations- och invasionsanalys

Den experimentella metoden för att upptäcka förmågan till cellmigration och invasion är Transwell-experimentet, och Transwell kallas även för perforeringsexperiment. Cellsuspensionen tillsätts först i kammaren eftersom kammaren har täta porer. Kamrarna placerades sedan i en 24-brunnars platta till vilken ett komplett medium tillsattes. Celler deformerades och passerade genom hål i kammaren till utsidan av den mer näringsrika kammaren, där de fastnade på utsidan. Genom att färga och räkna cellerna utanför kammaren kan cellernas migrations- och invasionsförmåga bedömas. Principen för Transwell är att placera den lilla kammaren i odlingsplattan, den lilla kammaren kallas den övre kammaren och odlingsplattan kallas den nedre kammaren. De övre och nedre skikten av odlingsvätska separeras av ett polykarbonatmembran, det övre skiktet av odlingsvätska läggs till den övre kammaren och det nedre skiktet av odlingsvätska läggs till den nedre kammaren. Cellerna finns i den övre kammaren, och sammansättningen av det undre mediet kommer att påverka cellerna i den övre kammaren på grund av membranets permeabilitet. Vidare undersöktes effekterna av komponenterna i det lägre mediet på celltillväxt och rörelse.
Specifika funktioner för Ceturegel™ basalmembranmatris i migrations- och invasionsanalyser: Den utspädda Ceturegel™ basalmembranmatrisen sattes till den övre kammaren i Transwell, och cellerna pläterades och inkuberades i en 37°C, 5% CO₂ inkubator i 24 timmar, fixerad i 4 % paraformaldehyd och färgad med 0,1 % kristallviolett färgningslösning. Celler observerades och räknades under ett inverterat faskontrastmikroskop.

Figur 3. Resultat av kristallviolett färgning efter cellinvasion

4.2 Angiogenes

1) En dag före experimentet, ta ut Ceturegel™ Matrigel från frysen och placera den i ett 4°C kylskåp över natten för att tina upp medan du förkyler de använda förbrukningsvarorna.
2) Förvara alltid Ceturegel™ Matrigel i en islåda innan experimentet. Öppna den sterila förpackningen av angiogena objektglas och ta bort objektglasen.
3) Tillsätt 10 μl Ceturegel™ Matrigel till varje brunn. Observera att pipettspetsen ska vara vinkelrät mot toppen av det inre hålet när du lägger till Ceturegel™ Matrigel för att förhindra att Matrigel rinner genom det övre hålet och lämnar en limrester.
4) Täck först över objektglaset, förbered en 10 cm petriskål och lägg pappershanddukar indränkta i vatten för att göra en våt låda.
5) Lägg objektglasen i petriskålen och täck över petriskålen. Lägg den i en CO₂ inkubatorn, låt den stå i cirka 30 minuter, vänta tills gelén koagulerar och förbered cellsuspensionen samtidigt.
6) Förbered de digererade cellerna till en cellsuspension med en densitet på 2*10⁵ celler/ml och blanda noggrant.
7) Ta bort objektglaset som innehåller blodkärlet som har stelnat till en gel. Tillsätt 50 μl av cellsuspensionen till varje brunn, var noga med att hålla pipettspetsen vertikalt ovanför den övre brunnen och inte rör vid gelén i den nedre brunnen.
8) Tillsätt cellodlingsmediet, stäng locket och låt det stå. Efter en tid kommer alla celler att sjunka till ytan av Matrigel.

Figur 4. Graf för angiogenesresultat

Immunfluorescensfärgning

1) Ta försiktigt bort mediet från brunnarna utan att vidröra limmet eller cellnätverket. Späd kalcein i serumfritt medium till en slutlig koncentration av 6–8 µg/ml. Tillsätt cellfärgningslösning för att helt nedsänka cellerna och inkubera vid rumstemperatur i 30-40 minuter i mörker.
2) Tvätta tre gånger med PBS. Observera att PBS långsamt bör läggas till de övre brunnarna för att undvika att påverka cellerna. Fluorescensobservation med Ex=485 nm, Em=529 nm våglängd

Figur 5. Immunfluorescensfärgning av blodkärl

4.3 3D-cellodling

Till skillnad från traditionell cellkultur, reproducerar 3D-cellkultur in vivo-miljön av celler. Även enkla sfäroidmodeller kan kompensera för bristerna i monolagerkulturer. Dessa strukturer kan bilda gradienter av syre, näringsämnen, metaboliter och lösliga signaler, som i sin tur bildar olika cellpopulationer. 3D-cellodlingsteknik kan bättre simulera den naturliga miljön där celler lever i organismer, vilket gör interaktionerna mellan celler och biokemiska och fysiologiska svar mer realistiska. I en 3D-miljö liknar cellernas svar på endogena och exogena stimuli mer deras in vivo-svar.
Den specifika funktionen för Ceturegel™ basalmembranmatris i 3D-cellkultur är som följer: Blanda försiktigt Ceturegel™ basalmembranmatrisen med den justerade koncentrationen av encellig HepG2-suspension 1:1, och tillsätt 50 μl av den ovan blandade encellssuspensionen till den förkylda 24-brunnars förkylda cellspetsen med en droppformad 24-brunnsformad cellspets. odlades i en 37°C, 5 % CO2-inkubator, observerades och fotograferades varje dag.

Figur 6. 3D-cellodlingsresultat

Tabell 1. 3D-cellkultur Ceturegel™ basalmembranmatris Användningsreferens:

Obs: Olika satser av Ceturegel™ basalmembranmatris har en viss koncentrationsskillnad, den rekommenderade dosen är endast för referens

4.4 Tumörbildningsexperiment in vivo

Med det subkutana tumörbildningsexperimentet av HepG2-celler i nakna möss som ett exempel, användes Ceturegel™ basalmembranmatris och cellsuspension för 1:1 utspädning, och BALB/c-nu honmöss i åldern 4-5 veckor ympades subkutant. Den experimentella processen är som följer:
♦ Förbered HepG2-celler med logaritmisk tillväxt och celltäthet på cirka 80-90%, och byt färskt medium natten innan du samlar in celler.
♦ Cellerna smälts av trypsin. När cellerna blir runda och inte lämnar odlingsskålen avlägsnas trypsinet, det serumfria mediet tillsätts för att göra cellsuspensionen, centrifugeras och rengörs en gång, och slutkoncentrationen är 5 × 10⁷ celler/ml.
♦ Späd cellsuspensionen och Ceturegel™ basalmembranmatris i förhållandet 1:1 vid 4 ℃ för att framställa en slutkoncentration på 5 × 10⁷ celler/ml.
♦ Ta tag i en fast nakenmus med vänster hand och injicera den subkutant på höger axel på nakenmusen. Under inokuleringen sätts nålen subkutant in lite djupare, ca 1 cm djup, för att minska överflödet av cellsuspension från nålögat efter injektionen.
Ympningsvolymen är 200 μ L。 (Denna process bör slutföras inom en halvtimme så långt som möjligt. På vägen bör cellsuspension placeras på is för att bromsa cellapoptos och förhindra gelfenomen).
♦ Sätt tillbaka de nakna mössen i buren för att fortsätta mata, och tumören kan ses i cirka 1 vecka till 1 månad.Enligt den experimentella designen, avliva de nakna mössen när tumörvolymen uppfyller kraven och ta bilder.

Obs: Kontrollgruppen är suspensionen av odlingsmediet och cellerna, och den slutliga densiteten är densamma som för matrislimtestgruppen.

4.5 Organoid kultur

Organoider är 3D flercelliga små vävnader som är differentierade från stamceller. Vissa egenskaper hos organ kan reproduceras. Organoider är flercelliga och uppvisar en hög grad av självmontering och är därför bättre i stånd att uppvisa komplexa in vivo cellulära svar och interaktioner än traditionella 2D-kulturer. Stamceller och/eller progenitorceller från organ från normal eller sjuk vävnad kan blandas med Ceturegel™ basalmembranmatris eller kollagen. Bildar njure, sköldkörtel, lever, hjärna, lunga, tarm, prostata och andra mikroorgan. Till exempel, för forskare som utför genetiska screeningar, kan Ceturegel™ basalmembranmatrissubstrat användas som biobläck för att möjliggöra exakt lokalisering och inbäddning av levande celler/organoider i 3D-bioprinting.

Figur 7. Organoid operationsprocess

Mus tunntarmsorganoidkonstruktion

Provberedning: Mössen dödades genom att skära av halsen och ytan sprayades med alkohol för sterilisering. Klipp ut tarmvävnaden 3 ~ 15 cm nära magänden under den sterila miljön, ta försiktigt bort mesenteriet och fettet utanför tarmkanalen med pincett och lägg det i DPBS-lösningen innehållande 1% dubbel antikropp förkyld vid 4 ℃.

Provrengöring: använd en spruta för att spola tarmkanalen 2-3 gånger, använd en kirurgisk sax för att försiktigt klippa tarmkanalen med tarmhålan uppåt och använd ett kirurgiskt blad för att försiktigt skrapa bort tarmvilli på ytan av tarmhålan, och efter att den genomskinliga tarmvävnaden har skrapas bort en ny tarmvävnad, placeras den ny tarmvävnad skål som innehåller DPBS i 2-3 gånger.

Inledande behandling av prover: skär den tvättade tunntarmsvävnaden i 2 mm breda små bitar och överför dem sedan till ett nytt 50 ml centrifugrör. Tvätta dem försiktigt 3-5 gånger med DPBS för att ta bort tarmvillusceller och flytande fettvävnad.

Provuppslutning: tillsätt 10-15 ml förkyld DPBS innehållande 3-5 mM EDTA till de rengjorda tunntarmsfragmenten för matsmältning, inkubera vid 4 ℃ i cirka 30 minuter och skaka försiktigt centrifugröret var 10:e minut under denna period.

Efter digestion, kassera supernatanten av EDTA digestion lösningen och skölj försiktigt vävnaderna med ny DPBS buffertlösning 2-3 gånger för att ta bort återstående EDTA.

Tillsätt 10-15 ml förkyld DPBS innehållande 0,1 % BSA i tunntarmsvävnadsfragmenten, blås och återsuspendera vävnadsfragmenten upprepade gånger för att separera fördjupningen från basalskiktet, ta sedan en liten suspension för mikroskopisk undersökning. När ett stort antal fördjupningsliknande strukturer ses, sluta blåsa och använd 70 % för den blåsta vävnadssuspensionen μM filterskärm för att filtrera och samla upp vävnadssuspensionen som passerar genom filtersilen.

Upprepa steg 5-6 två gånger och centrifugera vid 1500 rpm och 4 ℃ i 3 minuter.

Bildning av blandning: Ceturegel™ Matrix lim tung suspension fördjupning vävnadsutfällning, varje 10 μL matris lim suspension innehåller 200~600 fördjupningar. Efter återsuspension placeras blandningen på is och körs så snart som möjligt för att undvika den matrislimbildande gelen.
Obs: utspädningsförhållandet för matrislim ≥ 50 % för att säkerställa att Ceturegel™ i odlingsprocessen är stabil hos matrislimstrukturen.

Plantera den blandade suspensionen i mitten av botten av plattan med 24 brunnar, 30 ~ 50 μL per brunn till vänster och höger för att undvika att suspensionen kommer i kontakt med öppningsplattans sidovägg.

Placera den odlade odlingsplattan i 37 ℃ koldioxidinkubatorn med konstant temperatur och inkubera den i cirka 30 minuter tills matrisgelen stelnar.

Vänta på Ceturegel™ När matrislimmet har stelnat helt, tillsätt långsamt det förberedda odlingsmediet för tarmorgan längs väggen, 800 μL per brunn.

Sätt 24-brunnars plattan i 37 ℃ koldioxidinkubatorn för odling. Byt ut det färska mediet var tredje dag och övervaka tillväxtstatusen för ett organ som organ. Generellt bildas tunntarmsorganliknande organ hos möss inom 5-7 dagar.

Figur 8. Resultat av in vitro-odling av mus-tunntarmsliknande organ

5. Vanliga frågor

1. Vad är anledningen till färgskillnaden (ljusgul till mörkröd) för det erhållna substratet?
För Ceturegel™ basalmembranmatris som innehåller fenolrött, orsakas den huvudsakligen av interaktionen mellan fenolrött och bikarbonat med CO₂, men färgskillnaden kommer att minska efter utjämning med 5 % CO₂. Efter frysning och upptining, skaka flaskan försiktigt för att fördela Ceturegel™ basalmembranmatrisen jämnt.
2. Vad bör man vara uppmärksam på när man använder Ceturegel™ basalmembranmatris?
Alla operationer ska utföras i en steril miljö och en förkyld pipett ska användas för att säkerställa att Ceturegel™ basalmembranmatrisen är homogeniserad.
3. Hur man fryser och förvarar Ceturegel™ basalmembranmatris för användning?
Den frusna och tinade Ceturegel™ Matrix LDEV-Free Ceturegel™ basalmembranmatrisen kan fördelas i flera små rör. Alla distributioner bör vara i förkylda kryovials, som snabbt bör frysas och förvaras för att undvika flera frysningar och upptining. Alla inblandade föremål bör förkylas före användning. Använd förkylda pipetter, spetsar och små rör för att hantera Ceturegel™ basalmembranmatris.

6. Valguiden för Ceturegel™ basalmembranmatris från Yeasen

Olika typer av Ceturegel™ basalmembranmatris har olika tillämpningar. Standardkoncentrationer av Ceturegel™ basalmembranmatris kan användas för polära cellkulturer, såsom epitelceller. Det kan främja differentieringen av olika celler och användas för tumörcellmigrering och invasionsexperiment. Höga koncentrationer av Ceturegel™ basalmembranmatris används i stor utsträckning in vivo och kan användas för experiment med tubulbildning. Låg tillväxtfaktors (GFR) huvudsakliga funktion är att eliminera störningen av tillväxtfaktorer i experimentet, och den är lämplig för studier med höga krav på basalmembranberedning. Ceturegel™ basalmembranmatris utan fenolröd kan eliminera störningen av fenolröd indikator och är lämplig för färgutvecklingsexperiment, såsom kolorimetri och fluorescensdetektion. Human embryonal stamcellskultur Ceturegel™ basalmembranmatris används speciellt för human embryonal stamcellskultur, inducerad pluripotent matarfri stamcellskultur. Yeasen tillhandahåller många typer av Ceturegel™ basalmembranmatris, du kan välja dem baserat på dina experiment.

Tabell 2. Ceturegel™ Matrix Valguide

Produkttyp	Katt nr.	Produktnamn	Matrigel Cat No.	Applikationsriktning
Grundkoncentration (8-12 mg/ml)	40183ES	Ceturegel™ Matrix LDEV-fri	356234/ 354234	Anpassa sig till 2D- och 3D-kultur-, invasion- och migrationsexperiment och kan också användas för in vivo tumörframkallande experiment
	40184ES	Ceturegel™ Matrix Phenol Rödfri, LDEV-fri	356237	Används främst för färgdetektering som fluorescensdetektionsexperiment etc
Tillväxtfaktorminskning	40185ES	Ceturegel™ Matrix GFR，LDEV-fri	354230	Främst för att utesluta störningar av tillväxtfaktorer på experimentet. Tillämpas på relaterad forskning om tillväxtfaktorer, signalvägar etc.
	40186ES	Ceturegel™ Matrix GFR, Fenol Rödfri, LDEV-fri	356231
Hög koncentration (≥18mg/ml)	40187ES	Ceturegel™ Matrix hög koncentration, LDEV-fri	354248	Används huvudsakligen i experiment som angiogenes, gelembolisering och tumörbildning in vivo (för angiogenes rekommenderas att den slutliga koncentrationen av Ceturegel™ basalmembranmatris ska vara ≥10mg/ml)
	40189ES (förfrågan)	Ceturegel™ Matrix hög koncentration, GFR, LDEV-fri	354263
	40188ES	Ceturegel™ Matrix hög koncentration, fenolrödfri, LDEV-fri	354262
För stamceller	40190ES	Ceturegel™ Matrix hESC-kvalificerad, LDEV-fri	354277	Används främst för stamcellsodling som hESC, iPSC, etc.
Organoid-specifik	40191ES (förfrågan)	Ceturegel™-matris för organoidkultur, fenolrödfri, LDEV-fri	356255	Ceturegel™ basalmembranmatris för Organoid Culture