1. เซลล์เดนไดรต์ (DC) คืออะไร?
เซลล์เดนไดรต์ (DC) เป็นเซลล์นำเสนอแอนติเจน (APC) ที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดในร่างกายมนุษย์ DC เป็น APC ชนิดเดียวที่สามารถกระตุ้นการแพร่กระจายของเซลล์ T ที่ไม่รู้จักได้อย่างมีประสิทธิภาพ APC ประเภทอื่นๆ (เช่น โมโนไซต์ แมคโครฟาจ เซลล์ B เป็นต้น) สามารถกระตุ้นได้เฉพาะเซลล์ T ที่ถูกกระตุ้นหรือถูกกระตุ้นเท่านั้น ดังนั้น เซลล์ DC จึงเป็นตัวเริ่มต้นการตอบสนองภูมิคุ้มกันของเซลล์ T ที่ปรับตัวได้ และมีบทบาทสำคัญอย่างยิ่งต่อภูมิคุ้มกันต่อเนื้องอก เซลล์ DC แสดงออกโมเลกุล MHC-I และ MHC-II บนพื้นผิวอย่างมากและมีเครื่องหมายบนพื้นผิวที่เฉพาะเจาะจง เซลล์ DC จะรับ ประมวลผล และกระตุ้นเซลล์ T เพื่อกระตุ้นแอนติเจน และในท้ายที่สุดจะกำหนดทิศทางการแบ่งตัวของเซลล์ T
2. ที่มาของ DC
เซลล์ DC มีอยู่ในร่างกายในปริมาณที่น้อยมาก การแยก DC ออกจากร่างกายโดยตรงนั้นใช้เวลานานมาก และปริมาณเซลล์ที่ได้ก็ต่ำมาก ซึ่งทำให้การวิจัยและการประยุกต์ใช้ DC มีข้อจำกัดอย่างมาก อย่างไรก็ตาม DC สามารถแยกความแตกต่างและเหนี่ยวนำได้จากเซลล์ตั้งต้นของ DC ในเนื้อเยื่อต่างๆ เช่น เซลล์ตั้งต้นในของเหลวไขกระดูก โมโนไซต์ในเลือดส่วนปลาย และเลือดจากสายสะดือ
สำหรับมนุษย์ เนื่องจากเลือดส่วนปลายของมนุษย์เป็นเลือดที่หาได้สะดวกที่สุดและมีโมโนไซต์จำนวนมากที่สุด วิธีที่นิยมใช้มากที่สุดคือการเหนี่ยวนำ DC จากเซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเลือดส่วนปลายของมนุษย์ (PBMC) สำหรับหนู วิธีที่นิยมใช้มากที่สุดคือการเหนี่ยวนำ DC จากเซลล์ไขกระดูก ซึ่งก็คือเซลล์เดนไดรต์ที่ได้จากไขกระดูก (BMDC)
รูปที่ 1 แผนผังของวิธีการเตรียม BMDC แบบคลาสสิก
3. วิธีการเตรียม BMDC
วิธีการทั่วไปในการเตรียม BMDC ของเมาส์ ได้แก่:
3.1 วิธีการเพาะเลี้ยง BMDC แบบคลาสสิก - วิธี Inaba (แบบดัดแปลง)
3.2 การเตรียมการ BMDC-Sons ขนาดใหญ่
3.3 การเตรียม BMDC ขนาดใหญ่ - วิธี Lutz
3.1 [วิธีการเพาะเลี้ยง BMDC แบบคลาสสิก] - วิธี Inaba (ปรับปรุงแล้ว)
-พื้นหลัง-
ก. จำนวน BMDC ที่ได้จากวิธี Inaba คือ 5-7 x 106/หนู;
ข. วิธี Inaba ดั้งเดิมใช้เฉพาะ GM-CSF เพื่อกระตุ้นการผลิต BMDC แม้ว่า BMDC ที่ได้จะมีความสามารถในการกระตุ้นที่แข็งแกร่งในปฏิกิริยาลิมโฟไซต์ผสม แต่ความสมบูรณ์ของ DC ไม่ดีเท่ากับการเหนี่ยวนำร่วมกันของ GM-CSF+IL-4 ดังนั้น วิธีที่ปรับปรุงในภายหลังจึงมักใช้การเหนี่ยวนำร่วมกันของ GM-CSF+IL-4
-ขั้นตอนการเพาะปลูก-
3.1.1 การได้รับเซลล์ไขกระดูกของหนู
1) หนู (อายุ 6-10 สัปดาห์) ถูกฆ่าโดยการเคลื่อนของกระดูกสันหลังส่วนคอ กระดูกต้นขาและกระดูกแข้งทั้งหมดได้รับการผ่าตัดเอาออก และเนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อรอบกระดูกจะถูกเอาออกให้ได้มากที่สุดด้วยกรรไกรและคีม
-บันทึก] อย่าให้กระดูกได้รับความเสียหาย.
2) ย้ายกระดูกไปยังม้านั่งที่สะอาดแล้วแช่ไว้ในจานเพาะเชื้อที่ผ่านการฆ่าเชื้อซึ่งมีแอลกอฮอล์ 70% เป็นเวลา 2-5 นาทีเพื่อฆ่าเชื้อและทำให้ปราศจากเชื้อ จากนั้นล้างด้วย PBS ที่ผ่านการฆ่าเชื้อสองครั้ง
3) ย้ายกระดูกไปยังจานเพาะเลี้ยงใหม่ที่มี PBS ตัดปลายกระดูกทั้งสองข้างด้วยกรรไกร จากนั้นใช้เข็มฉีดยาเพื่อสกัด PBS แทงเข็มเข้าไปในโพรงไขกระดูกจากปลายกระดูกทั้งสองข้าง แล้วล้างไขกระดูกลงในจานเพาะเลี้ยงซ้ำๆ จนกว่ากระดูกจะเปลี่ยนเป็นสีขาวทั้งหมด
4) รวบรวมสารแขวนลอยของไขกระดูกและกรองชิ้นส่วนเล็กๆ และเนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อออกด้วยตาข่ายไนลอน 200 เมช
5) ปั่นสารกรองที่อุณหภูมิ 1200 รอบต่อนาทีสำหรับ 5 นาที และทิ้งส่วนที่เป็นของเหลวใสออกไป
6) เติมบัฟเฟอร์ไลซิสเม็ดเลือดแดงแอมโมเนียมคลอไรด์ 2 มล. (1x) ลงไป แขวนลอยเซลล์ให้แขวนลอยอีกครั้ง แล้วฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3-5 นาที, สูงสุดถึง 10 นาที
7) เติม PBS 10 มล. เพื่อทำให้ผลของบัฟเฟอร์ไลซิสเป็นกลาง จากนั้นปั่นเหวี่ยงที่ 1,200 รอบต่อนาที 5 นาที และทิ้งส่วนที่เป็นของเหลวใสออกไป
8) ล้างด้วย PBS หนึ่งครั้ง จากนั้นนำเซลล์กลับคืนสู่สภาวะปกติในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI1640 ที่มี FBS 10% เซลล์ไขกระดูกของหนูได้รับแล้ว
การเตรียมสารละลายสลายเม็ดเลือดแดงด้วยแอมโมเนียมคลอไรด์:
ก. เตรียมสารละลายจัดเก็บ 10x ดังต่อไปนี้: ชั่งน้ำหนัก 82.9 จี NH4Cl, 10.0 กรัม KHCO3 และโซเดียม 0.37 กรัม2EDTA ละลายในน้ำกลั่น 1 ลิตร กรองด้วย 0.22 แผ่นกรอง μm เพื่อฆ่าเชื้อ และเก็บไว้ที่ 4℃ เป็นเวลา 6 เดือน
ข. ก่อนใช้งาน ให้เจือจางสารละลายเก็บรักษา 10 เท่าด้วยน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อในอัตราส่วน 1:9 ถึงสารละลายทำงาน 1 เท่า
-บันทึก] เนื่องจากสารละลายสลายเม็ดเลือดแดงด้วยแอมโมเนียมคลอไรด์มีผลเสียต่อเซลล์ไขกระดูก ดังนั้นควรลดเวลาในการสลายเม็ดเลือดแดงให้สั้นลงให้มากที่สุด
3.1.2 การเหนี่ยวนำการแยกตัวของ BMDC
1) นับเซลล์ไขกระดูกของหนูที่ได้ในขั้นตอนที่ 1 และปรับความเข้มข้นของเซลล์เป็น 0.5-1× 106/มล. ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI 1640 สมบูรณ์ที่มี FBS 10%
2) ใส่ลงในจานเพาะเลี้ยง 24 หลุม เซลล์ 1 มล. ต่อหลุม เติม GM-CSF ของเมาส์รีคอมบิแนนท์ (20 นาโนกรัม/มล.) และ IL-4 (10 นาโนกรัม/มล.) และเพาะเลี้ยงในอุณหภูมิ 37℃, 5% CO2 ตู้ฟักไข่ วันนี้เป็นวันที่ 0 ของการเพาะเลี้ยง
-บันทึก-
ก. โดยทั่วไปประมาณ 4-5x107 สามารถเก็บเกี่ยวเซลล์ไขกระดูกจากหนูหนึ่งตัว ดังนั้นจึงสามารถเพาะเซลล์ไขกระดูกได้อย่างน้อย 40-50 หลุมจากแผ่นเพาะที่มี 24 หลุม
ข. ช่วงความเข้มข้นของ GM-CSF และ IL-4 อยู่ที่ 20-50 นาโนกรัม/มล. และ 10-40 นาโนกรัม/มล.ตามลำดับ
3) เขย่าจานเพาะเลี้ยงเบาๆ ทุกๆ 2 วัน จากนั้นเปลี่ยนปริมาตร 3/4 ด้วยอาหารเพาะเลี้ยงสด และเติมไซโตไคน์ใหม่
4) ระหว่างวันที่ 5 ถึงวันที่ 8 ให้เป่าอาหารเลี้ยงเชื้อเบาๆ เพื่อรวบรวมเซลล์ที่แขวนลอยและเซลล์ที่เกาะติดอย่างหลวมๆ
5) เครื่องเหวี่ยงที่ 1200 รอบต่อนาทีสำหรับ 5 นาที และทิ้งส่วนที่เป็นของเหลวใสออกไป
6) แขวนลอยเซลล์ใหม่ในอาหารเลี้ยงเชื้อสมบูรณ์ RPMI 1640 ที่มี FBS 10% แล้วนับจำนวน จากนั้นปรับความเข้มข้นของเซลล์เป็น 1×106/ml และเติม GM-CSF ของเมาส์รีคอมบิแนนท์ (20 นาโนกรัม/มล.) และ IL-4 (10 นาโนกรัม/มล.-
7 ) เพาะเซลล์ลงในจานเพาะเลี้ยงขนาด 100 มม. (สูงสุด 10 มล. ต่อจาน) หรือจานเพาะเลี้ยง 6 หลุม (2 ม./หลุม)
8) ดำเนินการเพาะเลี้ยงต่อที่อุณหภูมิ 37℃, 5% CO2 ตู้ฟักไข่ 1-2 วัน
9) รวบรวมเซลล์ที่ถูกแขวนลอยซึ่งเป็น BMDC ที่มีอายุมากขึ้น
-บันทึก-
ก. ขั้นตอนที่ 2.5-2.8 เป็นขั้นตอนการชุบใหม่ ซึ่งมีจุดประสงค์เพื่อให้ BMDC ที่ได้จากขั้นตอนที่ 2.4 มีความสมบูรณ์มากยิ่งขึ้น
ข. ภายใน 3 ชั่วโมงหลังการเพาะเลี้ยงใหม่ จะเห็นเซลล์ที่มีหนามจำนวนมากอพยพออกจากกลุ่ม DC และหลังการเพาะเลี้ยง 1 วัน จะพบว่าเซลล์ที่มีหนามเหล่านี้หลุดออกจากก้นจานเพาะเลี้ยง และจะเห็น DC ทั่วไปจำนวนมากลอยอยู่ในอาหารเพาะเลี้ยง
3.1.3. การเติบโตเต็มที่ของ BMDC
[หมายเหตุ] BMDC ที่ได้ในขั้นตอนที่ 2 ไม่ใช่ DC ที่โตเต็มที่ หากคุณต้องการ DC ที่โตเต็มที่ คุณยังต้องได้รับการเหนี่ยวนำโดย LPS, CD40L หรือ TNF-a
1) ปั่น BMDC ที่ได้ในขั้นตอน 2.4 หรือ 2.9 ที่อุณหภูมิ 1200 องศา รอบต่อนาทีสำหรับ 5 นาที และทิ้งส่วนที่เป็นของเหลวใสออกไป
2) ทำให้ตะกอนแขวนลอยใหม่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อสมบูรณ์ RPMI ที่มี GM-CSF ของเมาส์แบบรีคอมบิแนนท์ (20 นาโนกรัม/มล.) และ IL-4 (10 นาโนกรัม/มล.) และปรับความเข้มข้นของเซลล์เป็น 1×106/มล. หลังจากนับแล้ว
3) เพิ่มลงในจานเพาะเลี้ยง 24 หลุมและเติมสารกระตุ้นการสุก เช่น TNF-α (250 ยู/มล.), แอลพีเอส (1 μg/mL) หรือ CD40L (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร
4) เพาะเลี้ยงในอุณหภูมิ 37℃, CO 5%2 ตู้ฟักไข่ 2 วัน
5) เก็บรวบรวมเซลล์ที่แขวนลอยอยู่และเซลล์ที่เติบโตเกาะติดกับผนังอย่างหลวมๆ ซึ่งเป็นเซลล์เดนไดรต์ที่โตเต็มที่
3.2-วิธีการผลิตแบบ BMDC จำนวนมาก--วิธีลูกชาย
-พื้นหลัง-
ก. วิธีนี้สามารถได้ 30-40×106 DC/เมาส์ภายใน 7 วัน ซึ่งมากกว่าวิธีคลาสสิกของ Inaba ถึง 7-10 เท่า หลังจาก DC ถูกปั่นผ่านเมทริซาไมด์แบบไล่ระดับ 14.5% ความบริสุทธิ์ (เช่น เซลล์ CD11c+/I-Ab+) สามารถไปถึง 85-95%
ข. ความสามารถในการรับเข้าเซลล์ของ DC ที่ได้จากวิธีนี้จะอ่อนแอกว่าวิธีคลาสสิกของ Inaba แต่ปริมาณของ IL-12p70 ที่หลั่งออกมาจะใกล้เคียงกัน
ค. DC ที่ได้จากวิธีนี้มีความสามารถในการกระตุ้นที่แข็งแกร่งกว่าในปฏิกิริยาลิมโฟไซต์แบบผสมเมื่อเทียบกับวิธีคลาสสิกของ Inaba
ข. DC ที่ได้จากวิธีนี้สามารถกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองของเซลล์ T เฉพาะที่แข็งแกร่งขึ้นได้
อี โดยสรุป วิธี Son สามารถรับ BMDC ที่สมบูรณ์ยิ่งขึ้นและมากกว่าวิธีคลาสสิก
-ขั้นตอนการเพาะปลูก-
3.2.1 การได้รับเซลล์ไขกระดูกของหนู
ดูขั้นตอนที่สอดคล้องกันในวิธี Inaba (แก้ไขแล้ว)
3.2.2 การเตรียม BMDC จำนวนมาก
1) นับเซลล์ไขกระดูกของหนูที่ได้ในขั้นตอนที่ 1 และปรับความเข้มข้นของเซลล์เป็น 2×105/มล. ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI 1640 ที่สมบูรณ์ที่มี FBS 10%-
2) กระจายลงในจานเพาะเลี้ยง 6 หลุม เซลล์ 5 มล. ต่อหลุม เติม GM-CSF ของเมาส์แบบรีคอมบิแนนท์ (1,000 ยู/มล.) และ IL-4 (1000 ยู/มล.) และเพาะเลี้ยงในอุณหภูมิ 37℃, 5% CO2 ตู้ฟักไข่-
3) ในวันที่ 4 ของการเพาะเลี้ยง ให้เสริมระบบการเพาะเลี้ยงด้วย GM-CSF ของเมาส์แบบรีคอมบิแนนท์ (1,000 ยู/มล.) และ IL-4 (1000 ยู/มล.--
4) เก็บ DC ในวันที่ 7 ของการเพาะเลี้ยง พักฟื้นอีกครั้งในวันที่ 2-4 มิลลิลิตรของอาหารเลี้ยงเชื้อที่สมบูรณ์ RPMI 1640 เติมเมปานีมา 14.5% (w/v) ลงในปริมาตรเท่ากัน แล้วปั่นเหวี่ยงที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 ขั้นต่ำที่ 1200xg-
5) รวบรวมชั้นกลางและล้างด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อสมบูรณ์ RPMI 1640 สามครั้งเพื่อใช้ในภายหลัง
[บันทึก] ณ จุดนี้ DC ถือเป็น BMDC ที่ยังไม่พัฒนาเต็มที่ หากคุณต้องการพัฒนาให้สมบูรณ์ยิ่งขึ้น โปรดข้ามไปที่ขั้นตอนที่ 3
3.2.3 BMDC มีอายุครบกำหนด
1) ชุบ BMDC ที่เก็บรวบรวมไว้ในขั้นตอน 2.4 อีกครั้ง และเพิ่ม GM-CSF ของเมาส์รีคอมบิแนนท์ (1,000 ยู/มล.) และ IL-4 (1000 ยู/มล.) รวมถึง LPS (1-10 ไมโครกรัม/มล.) สู่ระบบวัฒนธรรม
2) เพาะเลี้ยงในอุณหภูมิ 37℃, CO 5%2 ฟักไข่เป็นเวลา 2 วันเพื่อให้ได้ BMDC ที่โตเต็มที่
3.3-วิธีการเตรียมมวล BMDC--วิธีลุตซ์
-พื้นหลัง-
ก. วิธี Lutz มีลักษณะคล้ายกับวิธี Son และทั้งสองวิธีสามารถเตรียม BMDC ได้ในปริมาณมาก แต่ใช้กันแพร่หลายกว่าวิธี Son
ข. วิธีนี้สามารถรับ BMDC ได้มากขึ้นถึง 1-3 x 108 DC/เมาส์ และความบริสุทธิ์สามารถเข้าถึง 90-95%
ค. ความเข้มข้นของไซโตไคน์ที่ใช้ในวิธีนี้ต่ำกว่าวิธี Son มาก ซึ่งอยู่ที่เพียง 200 ยู/มล.และมันลดลงเหลือ 30-100 ยู/มล. ตั้งแต่วันที่ 8 ถึงวันที่ 10 ของการเพาะเลี้ยง ซึ่งสามารถช่วยประหยัดต้นทุนสารเคมีได้มาก
ข. ความแตกต่างที่ใหญ่ที่สุดระหว่างวิธีนี้กับวิธีคลาสสิกของ Inaba และวิธี Son คือการเพาะเลี้ยงเซลล์ไขกระดูกในจานเพาะเลี้ยงแบคทีเรีย (จานเพาะเชื้อ) แทนที่จะเป็นจานเพาะเลี้ยงเซลล์ Inaba อธิบายว่าจานเพาะเลี้ยงแบคทีเรียนั้นไม่ง่ายสำหรับแมคโครฟาจในไขกระดูกที่จะเกาะติดกับผนัง จึงยับยั้งการพัฒนาของแมคโครฟาจและหลีกเลี่ยงผลการยับยั้งของแมคโครฟาจต่อการทำให้ DC สุก นี่อาจเป็นเหตุผลหลักที่วิธีนี้สามารถได้ BMDC จำนวนมากด้วยความหนาแน่นของการเพาะเลี้ยงที่ต่ำกว่า
อี อย่างไรก็ตาม เวลาในการเพาะเลี้ยงด้วยวิธีนี้ค่อนข้างนาน โดยต้องใช้เวลา 10-12 วัน ในแง่หนึ่ง วิธีนี้เพื่อให้ได้ BMDC มากขึ้น ในอีกแง่หนึ่ง เม็ดเลือดขาวและลิมโฟไซต์ส่วนใหญ่ยากที่จะอยู่รอดได้นานขนาดนั้น ดังนั้น ความบริสุทธิ์ของ BMDC ที่ได้ในที่สุดจึงสามารถปรับปรุงให้ดีขึ้นได้
ฉ. วิธีนี้ใช้เฉพาะ GM-CSF สำหรับการเพาะเลี้ยงแบบเหนี่ยวนำ และ BMDC ที่ได้จะมีทั้ง DC ที่ยังไม่โตเต็มที่และโตเต็มที่ เพื่อปรับปรุงความโตเต็มที่ต่อไป จำเป็นต้องใช้ LPS หรือ TNF-α สำหรับการเพาะเลี้ยงอีก 1-2 วัน และเนื้อหาของเซลล์ DC ที่โตเต็มที่จะเพิ่มขึ้นเป็น 50-70%
-ขั้นตอนการเพาะปลูก-
3.3.1 การได้รับเซลล์ไขกระดูกของหนู
ดูขั้นตอนที่สอดคล้องกันในวิธี Inaba (แก้ไข) และสังเกตว่าควรละเว้นขั้นตอนการแตกของเม็ดเลือดแดง
3.3.2 การเตรียมความพร้อม BMDC ขนาดใหญ่
1) นับเซลล์ไขกระดูกของหนูที่ได้ในขั้นตอนที่ 1 และปรับความเข้มข้นของเซลล์เป็น 2×105/มล. ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อสมบูรณ์ RPMI 1640 ที่มี FBS 10%
2) เกลี่ยลงในจานเพาะเชื้อแบคทีเรียขนาด 100 มม. (Petri Dish) เซลล์ 10 มล. ต่อจาน และเติม GM-CSF ของเมาส์แบบรีคอมบิแนนท์ (200 ยู/มล.) และเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37℃ ตู้ฟัก CO2 5%
[บันทึก] ที่นี่ใช้จานเพาะเลี้ยงแบคทีเรีย ไม่ใช่จานเพาะเลี้ยงเซลล์
3) วันที่ 3 เติมอาหารเลี้ยงเชื้อที่สมบูรณ์ 10 มล. ที่มีเชื้อ 20 นาโนกรัม/มล. การนำ GM-CSF ของเมาส์รีคอมบิแนนท์มาใส่ในจานเพาะเลี้ยง
4) วันที่ 6 และ 8 เปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อครึ่งหนึ่ง คือ เก็บอาหารเลี้ยงเชื้อเก่า แขวนตะกอนเซลล์ใหม่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่สมบูรณ์ซึ่งมี 20 นาโนกรัม/มล. GM-CSF ของเมาส์รีคอมบิแนนท์หลังจากการปั่นเหวี่ยง แล้วจึงใส่เซลล์ที่แขวนลอยกลับเข้าไปในจานเดิม
5) วันที่ 10 สามารถเก็บเซลล์ซึ่งเป็น BMDC ได้
3.3.3 การเติบโตเต็มที่ของ BMDC
1) รวบรวมเซลล์ที่แขวนลอยโดยเป่า DC อย่างเบาๆ ในวันที่ 10 ของการเพาะเลี้ยงด้วยปิเปต และปั่นเหวี่ยงที่ 300xg เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง
2) ทิ้งส่วนที่เป็นของเหลวใสเหนือตะกอน แล้วแขวนตะกอนเซลล์ใหม่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI 1640 ที่สมบูรณ์ 10 มล. จากนั้นจึงเกลี่ยลงบนจานเลี้ยงเซลล์ขนาด 100 มม.
3) เพิ่ม GM-CSF ของเมาส์รีคอมบิแนนท์ (100 ยู/มล.) และ TNF-α (500 ยู/มล.) หรือ GM-CSF ของเมาส์รีคอมบิแนนท์ (100 ยู/มล.) และ LPS (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร);
4) ดำเนินการเพาะเลี้ยงต่อที่อุณหภูมิ 37℃, 5% CO2 ตู้ฟักไข่ 1-2 วัน
4. การระบุตัวตนของ BMDC
ล การสังเกตทางสัณฐานวิทยา: BMDC ส่วนใหญ่จะเติบโตเป็นกลุ่ม และเซลล์มีส่วนยื่นแบบเดนไดรต์หลายส่วน ซึ่งเห็นได้ชัดเจนมากขึ้นใน BMDC ที่โตเต็มที่
ล การวิเคราะห์ฟีโนไทป์ของเซลล์: การไหลเวียนของไซโตเมทรีถูกใช้เพื่อตรวจจับการแสดงออกของโมเลกุล CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC class II (IA/IE) บนพื้นผิวของเซลล์ DC BMDC แสดงออกโมเลกุลเหล่านี้ในระดับสูง และการแสดงออกของโมเลกุลเหล่านี้ใน BMDC ที่โตเต็มที่จะเพิ่มขึ้นอีก
ล ปฏิกิริยาลิมโฟไซต์ผสม (MLR): BMDC มีความสามารถในการกระตุ้นที่แข็งแกร่ง และยิ่งความสมบูรณ์มากขึ้น ความสามารถในการกระตุ้นก็จะแข็งแกร่งมากขึ้น
5. จะเลือกสารกระตุ้นการเจริญเติบโตอย่างไร?
LPS, CD40L และ TNF-α เป็นตัวเหนี่ยวนำการทำให้ DC สุกงอมที่ใช้กันทั่วไปและมีประสิทธิภาพสำหรับ DC ของมนุษย์และ DC ของหนู TNF-a มีความสามารถที่อ่อนแอที่สุดในการกระตุ้น DC สุกงอมในสามตัว LPS และ CD40L เป็นตัวเหนี่ยวนำที่แข็งแกร่งสำหรับ DC สุกงอมเต็มที่ในหลอดทดลอง การทำให้ DC สุกงอมที่เหนี่ยวนำโดยทั้งสองตัวมีความคล้ายคลึงกัน แต่สเปกตรัมไซโตไคน์ที่เหนี่ยวนำนั้นแตกต่างกัน BMDC ที่สุกงอมที่เหนี่ยวนำโดย CD40L แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการควบคุมภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่งที่สุดในร่างกาย รวมถึงการสร้างการตอบสนองภูมิคุ้มกันของเนื้องอกที่ป้องกันและรักษา ความเข้มข้นที่ใช้เพื่อกระตุ้น DC สุกงอมเต็มที่ด้วย LPS โดยทั่วไปคือ 1-10 μg/mL แต่จริงๆ แล้ว 0.1 μg/mL มีผลรุนแรงมาก แต่เพื่อวัตถุประสงค์ด้านการประกัน 1 โดยทั่วไปจะใช้ μg/mL โปรดทราบว่าโมเลกุล CD40L อยู่ในกลุ่มลิแกนด์ TNF ซึ่งมีลักษณะเฉพาะคือโมเลกุลเหล่านี้สามารถทำงานได้หลังจากสร้างไตรเมอร์เท่านั้น ดังนั้น จึงควรใช้โปรตีนไตรเมอร์ CD40L แบบรีคอมบิแนนท์เพื่อกระตุ้น DC ซึ่งจะให้ผลดี หากใช้โมโนเมอร์ CD40L เพื่อกระตุ้น DC ความสมบูรณ์ของ DC จะไม่สูงมากในกรณีส่วนใหญ่
6. การเลือกวิธีการฝึกอบรม
ตารางที่ 1.การเปรียบเทียบวิธีการทดลองทั่วไปสามวิธีในการเตรียม BMDC
| พารามิเตอร์ | วิธีการเพาะเลี้ยง BMDC แบบคลาสสิก - วิธี Inaba | การเตรียมการ BMDC ขนาดใหญ่ - วิธี Son | การเตรียมการ BMDC ขนาดใหญ่ - วิธี Lutz |
| จำนวนการอ้างอิงใน PubMed | 783 | 24 | 663 |
| ภาวะเม็ดเลือดแดงแตก ภาวะเม็ดเลือดแดงแตก | ใช่ | ใช่ | เลขที่ |
| ไขกระดูกจะกำจัดลิมโฟไซต์ออกก่อน | ใช่ | เลขที่ | เลขที่ |
| การกำจัดเม็ดเลือดขาวระหว่างการเพาะเลี้ยง | ใช่ | เลขที่ | เลขที่ |
| ปริมาตรการชุบเริ่มต้นของเซลล์ไขกระดูก | 1มล. | 15มล. | 10มล. |
| ตู้ฟักไข่ | จานเพาะเลี้ยงเซลล์ 24 หลุม | จานเพาะเลี้ยงเซลล์ 6 หลุม | จานเพาะเชื้อขนาด 100 มม. |
| อาหารเลี้ยงเชื้อ | RPMI 1640+10% เอฟซีเอส | ||
| ความเข้มข้นของ GM-CSF ของหนู | 200-1,000 ยู/มล. | ความเข้มข้นเริ่มต้นที่เพิ่มเข้ามาคือ 125-1000 ยู/มล. ในวันที่ 4 และ 7 จะมีการเติม GM-CSF และ IL-4 ลงในระบบการเพาะเลี้ยงในปริมาณที่เพียงพอ | ความเข้มข้นที่เพิ่มเริ่มต้นคือ 200 ยู/มล.-3-100 ยู/มล. หลังจากวันที่ 10 |
| เมาส์ IL-4 | ไม่จำเป็น | ความต้องการ-ความเข้มข้นเท่ากับ GM-CSF | ไม่จำเป็น |
| วิธีการแลกเปลี่ยนของเหลว | ในวันที่ 2 และ 4 ทิ้งอาหารเลี้ยงเชื้อเก่า (ที่มีเซลล์อยู่) 50%-75% และแทนที่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อสมบูรณ์ใหม่ที่มี GM-CSF เพียงพอ | - | ในวันที่ 3 เติมอาหารเลี้ยงเชื้อที่สมบูรณ์ที่มี GM-CSF ในปริมาณที่เท่ากัน ในวันที่ 6, 8 และ 10 เติมอาหารเลี้ยงเชื้อครึ่งหนึ่ง อาหารเลี้ยงเชื้อเดิม (ที่มีเซลล์) จะถูกดูดออก ปั่นเหวี่ยง แล้วทำให้แขวนลอยใหม่ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่สมบูรณ์ใหม่ที่มี GM-CSF จากนั้นจึงใส่กลับเข้าไป |
| เวลาการเพาะเลี้ยงก่อนการผ่าน(ขยาย) | 6 วัน | 7 วัน | 10 วัน |
| ระยะเวลาในการเพาะเลี้ยงหลังจากการผ่าน (การสุก) | 2 วัน | ไม่มี | 1-2 วัน |
| ตัวกระตุ้นการเจริญเติบโตเต็มที่ | TNF-ɑ-250 ยู/มล.- | แอลพีเอส(1-10 ไมโครกรัม/มล.) | TNF-ɑ-250 ยู/มล.-หรือ LPS(1 ไมโครกรัม/มล.) |
| เวลาการเก็บเกี่ยวเซลล์ DC | 7-8 วัน | 7-8 วัน | 10-13 วัน |
| ดีซี บริสุทธิ์ | วันที่ 8-60-70% | วันที่ 7-85-95% | วันที่ 10-12-80-90% |
| DC การผลิต/เมาส์ | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. น้ำยาเพาะเลี้ยง DC ที่แนะนำ
| ชื่อสินค้า | แมว | ขนาด |
| 91108อีเอส | 5 ไมโครกรัม/50 ไมโครกรัม/100 ไมโครกรัม/500 ไมโครกรัม | |
| 90144ES | 5 ไมโครกรัม/50 ไมโครกรัม/100 ไมโครกรัม/500 ไมโครกรัม | |
| 90621ES | 5 ไมโครกรัม/20 ไมโครกรัม/50 ไมโครกรัม/500 ไมโครกรัม | |
| 94016ES | 25 ไมโครกรัม/100 ไมโครกรัม/500 ไมโครกรัม |