1.ความเป็นมาของลามินิน 521
ลามินิน 521 (LN521) เป็นโปรตีนยึดเกาะเซลล์หลักในช่องเซลล์ต้นกำเนิดตามธรรมชาติและเป็นเมทริกซ์สำหรับการเพาะเลี้ยงและขยายพันธุ์ของเซลล์ต้นกำเนิดเอ็มบริโอของมนุษย์ (hES) และเซลล์ต้นกำเนิดพลูริโพเทนต์ที่ถูกเหนี่ยวนำ (hiPSC) LN521 จับกับตัวรับบนพื้นผิวเซลล์และกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณของเซลล์ ส่งผลให้มีการสร้างเซลล์ที่มีการทำงานได้มากขึ้น
Laminin 521 สร้างสภาพแวดล้อมที่เกี่ยวข้องกับ hPSC ในหลอดทดลอง ส่งเสริมการยึดเกาะ การอยู่รอดสูง และการต่ออายุตัวเองในระยะยาวที่แข็งแกร่งของ hPSC และเป็นโปรตีนเมทริกซ์หลักที่รองรับการเติบโตของเซลล์ต้นกำเนิดและรักษาเสถียรภาพของโครงสร้างและประสิทธิภาพของเยื่อฐาน Laminin 521 ยังเป็นเมทริกซ์วัฒนธรรมที่ปราศจากสารอาหารที่ใช้กันทั่วไปที่สุดชนิดหนึ่ง นอกจากนี้ Laminin 521 ยังสามารถบรรลุการผ่านเซลล์เดียวที่มีประสิทธิภาพของเซลล์ต้นกำเนิดที่เสถียรทางพันธุกรรมและมีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างโดยไม่ต้องเติมสารยับยั้งอะพอพโทซิสใดๆ เซลล์จะเติบโตในชั้นเดียวที่สม่ำเสมอโดยไม่จำเป็นต้องกำจัดพื้นที่การแยกตัวด้วยมือ นอกจากนี้ การศึกษายังแสดงให้เห็นว่า LN521 สามารถรองรับการเติบโตของ PSC ได้นานกว่า 10 รุ่นโดยไม่มีสัญญาณของความผิดปกติของแคริโอไทป์ และรักษาความสามารถของ PSC ในการแยกตัวออกเป็นชั้นเชื้อโรคสามชั้น ได้แก่ ชั้นเชื้อโรคชั้นใน ชั้นกลาง และชั้นเชื้อโรคชั้นนอก
รูปที่ 1. โครงสร้างของลามินิน 521 [1]
2.การทดลองเคลือบลามินิน
2.1 เตรียมลามินิน 521 ถึง 400 ไมโครกรัม/มล. ด้วยน้ำที่ผ่านการดีไอออนไนซ์หรือน้ำสำหรับฉีดที่ผ่านการฆ่าเชื้อ แนะนำให้เจือจางลามินินอีกเป็น 100 ไมโครกรัม/มล. ด้วย 1×DPBS (Ca++/Mg++) ที่ผ่านการฆ่าเชื้อก่อนใช้ จากนั้นจึงเจือจางลามินินจนมีความเข้มข้นในการทำงาน 5-10 ไมโครกรัม/มล. ด้วย DPBS (Ca++/Mg++) ที่ผ่านการฆ่าเชื้อ ความเข้มข้นของสารเคลือบจะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับประเภทของเซลล์ที่เพาะเลี้ยง และขอแนะนำให้ปรับโปรโตคอลการทดลองให้เหมาะสมเพื่อกำหนดความเข้มข้นของสารเคลือบที่เหมาะสมสำหรับเซลล์ โปรดดูตารางที่ 1 สำหรับความเข้มข้นที่แนะนำ
บันทึก: DPBS ที่มี Ca2+ และแมกนีเซียม2+ ควรใช้เนื่องจากไอออนบวกที่มีประจุบวก 2 มีความสำคัญต่อโครงสร้างและหน้าที่ของโปรตีน ความเข้มข้นที่ต้องการในการทำงานสำหรับ Laminin 521 ขึ้นอยู่กับเซลล์และการใช้งาน เราขอแนะนำให้ใช้ความเข้มข้นเริ่มต้นของการเคลือบที่ 0.5 ไมโครกรัมต่อลูกบาศก์เซนติเมตร2-
ตารางที่ 1 ปริมาตรที่แนะนำของสารละลายทำงานลามินินของมนุษย์รีคอมบิแนนท์สำหรับภาชนะเพาะเลี้ยงที่แตกต่างกัน
| จานเพาะเชื้อ | ความเข้มข้นของสารเคลือบ (μg/mL) | ปริมาณการเติม LN521 | จำนวนเพิ่มเติม 1*DPBS | ปริมาตรรวม |
| 6 บ่อ | 5 | 50 μL/หลุม | 950 μL/หลุม | 1 มล./หลุม |
| 12 บ่อ | 5 | 25 μL/หลุม | 475 μL/หลุม | 0.5 มล./หลุม |
| 24 บ่อ | 5 | 15 μL/หลุม | 285 μL/หลุม | 0.3 มล./หลุม |
| 48 บ่อ | 5 | 7.5 μL/หลุม | 142.5 μL/หลุม | 150 μL/หลุม |
| 96บ่อน้ำ | 5 | 3.5 μL/หลุม | 66.5 μL/หลุม | 70 μL/หลุม |
| จานเพาะเชื้อขนาด 35 มม. | 5 | 50 μL/หลุม | 950 μL/หลุม | 1 มล./หลุม |
| จานเพาะเชื้อขนาด 60 มม. | 5 | 100 μL/หลุม | 1900 μL/หลุม | 2 มล./หลุม |
| จานเพาะเชื้อขนาด 100 มม. | 5 | 300 μL/หลุม | 5700 μL/หลุม | 6 มล./หลุม |
ปริมาตรข้างต้นขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของการเคลือบ 5μg/mL
2.2 เติมส่วนผสมลามินิน-ดีพีบีเอสในปริมาณที่กำหนดลงในแต่ละหลุมแล้วเขย่าเบาๆ ตรวจสอบให้แน่ใจว่าพื้นผิวทั้งหมดถูกปกคลุมด้วยสารเคลือบลามินิน เนื่องจากพื้นผิวที่ไม่ได้เคลือบจะไม่ช่วยให้เซลล์เติบโตได้
2.3 วางแผ่นเพาะเลี้ยงในตู้เพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37°C และเพาะเลี้ยงข้ามคืน เวลาในการเพาะเลี้ยงขั้นต่ำคือ 2 ชั่วโมง แต่แนะนำให้เพาะเลี้ยงข้ามคืนเพื่อให้ได้สภาวะการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่เหมาะสม ระวังอย่าให้ภาชนะเพาะเลี้ยงแห้ง เพราะจะทำให้ LN521 ไม่ทำงาน
2.4 เมื่อเซลล์พร้อมที่จะเพาะ ให้ดูดสารละลายลามินิน 521 ออกมา
3. วัฒนธรรม iPSC
3.1 การละลายน้ำแข็ง iPSC (ใช้แผ่น 12 หลุมเป็นตัวอย่าง)
3.1.1 นำ iPSC ออกจากไนโตรเจนเหลวหรือน้ำแข็งแห้ง แล้วละลายในน้ำ 37°C เป็นเวลา 10 วินาที
3.1.2 ฆ่าเชื้อหลอดแช่แข็งด้วยแอลกอฮอล์ 75% และถ่ายโอนไปยังพื้นผิวการทำงาน
3.1.3 ถ่ายโอนเซลล์ไปยังหลอดเหวี่ยงใหม่ขนาด 15 มล. ที่บรรจุ DMEM‑F12 ขนาด 9 มล.
3.1.4 ปั่นหลอดปั่นขนาด 15 มล. ที่ 300 กรัม เป็นเวลา 5 นาที ที่อุณหภูมิห้อง
3.1.5 ทิ้งสารละลายลามินินออกจากแผ่นเคลือบ 12 หลุม
3.1.6 ทิ้งของเหลวที่อยู่เหนือตะกอนของเซลล์ แล้วค่อย ๆ แขวนลอย iPSC ใหม่ใน mTeSR-plus 1 มล. (ที่มี Y-27632 10 µM) แล้วถ่ายโอนลงในเพลตเคลือบ 12 หลุม เขย่าเพลตเพื่อกระจายเซลล์ให้ทั่วถึงจนมีความหนาแน่นของเซลล์ขั้นสุดท้าย 1×10^5 เซลล์ต่อหลุม แล้วปล่อยทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเพาะเชื้อภายใน 4-5 วัน
3.1.7 นำแผ่น 12 หลุมกลับเข้าไปในตู้ฟักที่อุณหภูมิ 37°C เพื่อทำการฟัก
3.1.8 ควรเอาอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีสารยับยั้ง ROCK ออกหลังจากผ่านไป 12-16 ชั่วโมง และควรเลี้ยงต่อไปในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่มีสารยับยั้ง
ตารางที่ 2 ความหนาแน่นของการเพาะเซลล์ในภาชนะเพาะเลี้ยงที่แตกต่างกัน จำนวนเซลล์กำหนดตามอัตราการเจริญเติบโตของเซลล์
| ภาชนะเพาะเลี้ยงเซลล์ | 6 บ่อ | 12 บ่อ | 24 บ่อ | 96บ่อน้ำ |
| เบอร์มือถือ | 2.5~3.5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0.5~1×104 |
3.2. โปรโตคอลการส่งผ่าน iPSC
3.2.1 ทิ้งของเหลวที่อยู่เหนือตะกอนของวัฒนธรรมและล้างด้วย PBS (Ca) 1 มล.-/มก.--
บันทึก: ใช้ PBS ที่ไม่มี Ca2+ และ Mg2+ เนื่องจากไอออนบวก 2 ตัวมีผลเสียต่อเอนไซม์แยกตัวบางชนิด
3.2.2 ทิ้ง PBS และเติม Gentle Cell Dissociation Reagent 0.5 มล.ฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 6-8 นาที หรือสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์จนกระทั่งเซลล์ไม่เกาะติดกับแผ่นอีกต่อไป
3.2.3 เติม DMEM-F12 ในปริมาณเท่ากัน ผสมเซลล์เบาๆ ถ่ายโอนไปยังหลอดเหวี่ยงที่อุณหภูมิห้อง และเหวี่ยงที่ 300 กรัมเป็นเวลา 5 นาที
3.2.4 ก่อนที่จะผ่านเซลล์ ให้เตรียมแผ่นเคลือบลามินิน 12 หลุม
3.2.5 ทิ้งของเหลวส่วนบนและแขวนลอยเซลล์ใหม่ในอาหารเลี้ยงเชื้อ mTeSR‑plus ที่มี 10 ไมโครเมตร Y-27632.
3.2.6 ย้ายเซลล์ไปยังแผ่นเคลือบลามินิน 12 หลุมที่เตรียมไว้ เขย่าแผ่นเบาๆ เพื่อให้เซลล์กระจายอย่างทั่วถึง แล้วทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 ถึง 20 นาที
3.2.7 วางแผ่น 12 หลุมในตู้ฟักที่อุณหภูมิ 37°C และฟัก
บันทึก: iPSC จะแยกตัวและตายอย่างรวดเร็วหลังจากเติบโตเป็นเซลล์ชั้นเดียว เพื่อรักษาการเติบโตและความสามารถในการแบ่งตัวของเซลล์ เซลล์เหล่านี้จำเป็นต้องผ่านกระบวนการแยกตัวก่อนที่จะรวมเข้าด้วยกัน
3.3. การแช่แข็งเซลล์ iPSC
3.3.1 เตรียมสารเคมีแยกตัวของเซลล์อย่างอ่อนโยน
3.3.2 ดำเนินการแยกเซลล์ตามโปรโตคอลการส่งผ่าน iPSC ใช้การนับออร์แกเนลล์เซลล์เพื่อให้แน่ใจถึงความหนาแน่นของเซลล์ก่อนการแช่แข็ง
3.3.3 ควรแช่แข็งเซลล์แต่ละหลอดด้วยความหนาแน่นของเซลล์ 1-2×10^6 ปฏิบัติตามขั้นตอนของการปั่นเหวี่ยงและการกำจัดอาหารเลี้ยงเซลล์ในโปรโตคอลการส่งผ่าน iPSC นำเม็ดเซลล์ iPSC ที่แยกแล้วกลับคืนสู่สภาวะเดิมในสารละลายแช่แข็งที่มีปริมาตรที่เหมาะสม
3.3.4 เติมเม็ดแช่แข็งเซลล์ที่แขวนลอยใหม่ 1 มิลลิลิตรลงในหลอดแช่แข็งขนาด 1.5 มิลลิลิตร ทำการทำความเย็นตามโปรแกรม แล้วจึงถ่ายโอนไปยังไนโตรเจนเหลวเพื่อจัดเก็บในระยะยาว
4.หมายเหตุสำคัญเกี่ยวกับการเคลือบลามินิน
4.1. ขั้นตอนทั้งหมดในโปรโตคอลการทดลองจะต้องดำเนินการภายใต้สภาวะปลอดเชื้อ
4.2 หลีกเลี่ยงการให้ลามินินสัมผัสกับอุณหภูมิห้องเป็นเวลานาน
4.3. หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ
4.4. หลังจากละลายแล้ว สามารถเก็บสารละลายโปรตีนที่ไม่มีการเจือจางได้ที่อุณหภูมิ 2~8℃ ภายใต้สภาวะปลอดเชื้อ และสามารถเก็บไว้ได้อย่างเสถียรเป็นเวลาอย่างน้อย 3 เดือน
5.ข้อมูลสินค้าที่เกี่ยวข้อง
| ชื่อสินค้า | แมว# | ขนาด |
| 92602ES | 10ไมโครกรัม/100ไมโครกรัม/500ไมโครกรัม/1มก. |
6.เอกสารอ้างอิง
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E การวิเคราะห์ผลึกศาสตร์ของแขนสั้นลามินิน β2 เผยให้เห็นว่าโดเมน LF ถูกแทรกเข้าไปในอาร์เรย์ปกติของโดเมน LE ได้อย่างไร Matrix Biol. 2017 ม.ค.;57-58:204-212