Teln Telomerase: ไดรฟ์ใหม่ในการสังเคราะห์เอนไซม์ DNA

เมื่อพูดถึงเทโลเมียร์และโปรเทโลเมอเรส ในทางชีววิทยา จิตใจของผู้คนมักคิดถึงการแก่ชราซึ่งเป็นปรากฏการณ์ทางธรรมชาติที่หลีกเลี่ยงไม่ได้เป็นอันดับแรก เทโลเมียร์ เป็น ลำดับดีเอ็นเอซ้ำๆ ที่ปลายโครโมโซมยูคาริโอต ซึ่งมี ความรับผิดชอบในการรักษาความสมบูรณ์ของโครโมโซมและควบคุมวงจรการแบ่งเซลล์

โปรเทโลเมอเรส เป็นเอนไซม์สังเคราะห์ดีเอ็นเอทรานสคริปเทสย้อนกลับที่ขยายเทโลเมียร์ เป็นนิวคลีโอโปรตีนที่ประกอบด้วยอาร์เอ็นเอและโปรตีน ส่วนประกอบของโปรตีนสามารถเร่งปฏิกิริยาการสังเคราะห์ลำดับการทำซ้ำของเทโลเมียร์ได้ ที่มีส่วนประกอบของ RNA

รูปที่ 1 กลไกการขยายเทโลเมียร์ที่เกิดจากโปรเทโลเมอเรส^[1]

โปรเทโลเมอเรส สามารถซ่อมแซมและยืดเทโลเมียร์ ชดเชยข้อบกพร่องในการจำลองดีเอ็นเอ ป้องกันการสูญเสียเทโลเมียร์ระหว่างการแบ่งเซลล์ และเพิ่มจำนวนการแบ่งเซลล์ ในปี 2009 รางวัลโนเบลสาขาสรีรวิทยาหรือการแพทย์ได้มอบให้กับ Elizabeth H Blackburn, Carol W Greider และ Jack W Szostak สำหรับผลงานโดดเด่นในการเปิดเผยบทบาทสำคัญของเทโลเมียร์และโปรเทโลเมอเรส ในด้านการทำงานของเซลล์และการแก่ก่อนวัย

วันนี้ผมอยากแนะนำ Protelomerase ที่เป็นเอกลักษณ์เฉพาะตัวให้กับคุณ: TelN proProtelomerase TelN Protelomerase มาจากแบคทีเรียโฟจ N15 และเป็นส่วนประกอบของระบบจำลอง N15 ที่มีส่วนร่วม ในการสร้างดีเอ็นเอโปรฟาจเชิงเส้น ซึ่งแตกต่างจากโปรเทโลเมอเรส ในยูคาริโอต TelN เป็นเอนไซม์โปรตีนบริสุทธิ์ที่ไม่มีส่วนประกอบของ RNA ใดๆ มีกระบวนการแยก-ผูก กิจกรรมและทิ้งปลายปิดแบบโควาเลนต์ไว้ที่ไซต์การตัดหลังจากการตัดดีเอ็นเอสายคู่ (dsDNA)

รูปที่ 2. โปรเทโลเมอเรส TelN สถานที่แยกร่าง

เทลเอ็น โปรเทโลเมอเรส กลไกการออกฤทธิ์

ไซต์การจดจำของ TelN Protelomerase เป็นลำดับพาลินโดรมที่มีความยาว 56 คู่เบส โดยมี telR และ telL อยู่ทั้งสองด้าน ตำแหน่งตรงกลางของลำดับเป้าหมายยังเป็นลำดับพาลินโดรม telO อีกด้วย TelN โปรเทโลเมอเรส แตกออกภายในลำดับ telO และสร้างโครงสร้างกิ๊บปิดแบบโคเวเลนต์ที่ปลายแยกทั้งสองข้าง ปลายของ DNA หลังการย่อยยังคงประกอบด้วย telR และ telL ซึ่งเรียกว่า กระดูกหมา ดีเอ็นเอ (dbDNA)

รูปที่ 3. โปรเทโลเมอเรส กลไกการแยกส่วนที่ไซต์ TelN^[2]

เนื่องจากกิจกรรมพิเศษในการตัดและผูกมัดด้วยเอนไซม์ของ TelN Protelomerase จึงทำให้ DNA พลาสมิดแบบวงกลมสามารถแปลงเป็นโมเลกุลรูปดัมเบลล์แบบปิดโควาเลนต์เชิงเส้นได้โดยปฏิกิริยาเอนไซม์ขั้นตอนเดียว เมื่อเปรียบเทียบกับโมเลกุล DNA แบบเปิดเชิงเส้น DNA แบบปิดเชิงเส้นจะมีระดับการแสดงออกของโปรตีนในเซลล์สูงกว่า ซึ่งเหมาะมากสำหรับการสร้าง DNA ขนาดเล็กแบบปลายปิดเชิงเส้นที่มีเสถียรภาพสูงและมีลำดับแปลกปลอมน้อยที่สุด DNA พลาสมิดมีบทบาทสำคัญในฐานะองค์ประกอบหลักของวัคซีน mRNA วัคซีน DNA และการบำบัดด้วยยีนเซลล์ วิธีการผลิตพลาสมิดแบบดั้งเดิมเกี่ยวข้องกับการหมักด้วย อี.โคไล และการขยายพันธุ์แบบหลายขั้นตอน และความเสี่ยงที่ควบคุมไม่ได้ในกระบวนการหมักจำกัดผลผลิตของพลาสมิดคุณภาพสูง ซึ่งกลายเป็นกุญแจสำคัญในการจำกัดกำลังการผลิตวัคซีน บริษัท Touchlight ในสหราชอาณาจักรได้เปิดตัวเทคโนโลยี dbDNA ที่เป็นนวัตกรรมใหม่ เทคโนโลยีนี้ทำลายล้างวิธีการหมักแบคทีเรียแบบดั้งเดิมสำหรับการเตรียมดีเอ็นเอพลาสมิด และแทนที่จะใช้การสังเคราะห์ดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์ในหลอดทดลอง กิจกรรมการแยกและผูกเอนไซม์พิเศษของ TelN Protelomerase ยังใช้เพื่อสร้างดีเอ็นเอขนาดเล็กปลายปิดเชิงเส้นในวิธีการข้างต้นอีกด้วย

การประยุกต์ใช้ TelN Protelomerase ในการสังเคราะห์เอนไซม์ DNA

วิธีการทางเอนไซม์ในหลอดทดลองที่ใช้ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส phi29 และเทลเอ็นโปรเทโลเมอเรสสามารถหลีกเลี่ยงความเสี่ยงที่ควบคุมไม่ได้หลายประการในกระบวนการหมักทางชีวภาพ และวิธีการทางเอนไซม์ในหลอดทดลองสามารถสังเคราะห์ดีเอ็นเอได้อย่างรวดเร็วและให้ผลผลิตสูง ดีเอ็นเอที่สังเคราะห์สามารถใช้ในเทคโนโลยีใหม่ ๆ มากมาย เช่น วัคซีน mRNA วัคซีนดีเอ็นเอ เวกเตอร์ยีนบำบัด และการตัดแต่งยีน

รูปที่ 4 ผังงานการสังเคราะห์เอนไซม์ DNA^[3]

กระบวนการสังเคราะห์ DNA ด้วยเอนไซม์

เทมเพลตการทำลายธรรมชาติ

เทมเพลต DNA พลาสมิดวงกลมจะถูกแปลงเป็น DNA วงกลมสายเดี่ยว 2 ตัวโดยกระบวนการเปลี่ยนสภาพ

การขยายวงรอบหมุน

การขยายวงโรลลิ่งเซอร์เคิลทำได้โดยใช้ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส Phi29 และดีเอ็นเอวงกลมสายเดี่ยวเพื่อสร้างดีเอ็นเอคอนคาเทเมอริกสายคู่เชิงเส้นยาวที่มีช่วงลำดับการจดจำโปรเทโลเมอเรส

การตัดและการปิดแบบโควาเลนต์

TelN Protelomerase จดจำ telRL บน DNA ของคอมเพล็กซ์เทโลเมียร์ และดำเนินกิจกรรมการแยก-ผูกเพื่อสร้างโมโนเมอร์ DNA เชิงเส้นที่เชื่อมต่อแบบโควาเลนต์

การกำจัด DNA ของกระดูกสันหลังแบคทีเรีย

Restriction endonucleases หรือ exonucleases จะย่อยสลาย DNA ของโครงกระดูกแบคทีเรียด้วยโครงสร้างเปิดที่ปลายเพื่อให้ได้ DNA ที่มีองค์ประกอบการแสดงออกของยีนเป้าหมายเท่านั้น เทคโนโลยีการสังเคราะห์ DNA ด้วยเอนไซม์จะหลีกเลี่ยงการหมักทางชีวภาพและสามารถสังเคราะห์ DNA พลาสมิดในระดับ GMP ได้อย่างรวดเร็ว ช่วยแก้ปัญหาข้อจำกัดด้านกำลังการผลิตในสาขาการบำบัดด้วยยีนและวัคซีน mRNA เทคโนโลยีนี้มีศักยภาพมหาศาลสำหรับการผลิตเชิงอุตสาหกรรม เพื่อส่งเสริมการพัฒนาเทคโนโลยีการสังเคราะห์ DNA ด้วยเอนไซม์ Yeasen ชีววิทยาสามารถจัดหาสารเอนไซม์หลักสำหรับการสังเคราะห์เอนไซม์ DNA เช่น phi29 DNA polymerase (14404ES) และ TelN Protelomerase (14540ES) เพื่อช่วยเหลือในการวิจัยและการผลิตเทคโนโลยีการสังเคราะห์เอนไซม์ DNA

พีการนำเสนอผลงาน ของ Yeasenของ เทลเอ็น โปรเทโลเมอเรส

ประสิทธิภาพการรัด-แยกหัวนมเป็นเลิศ ซึ่งเทียบเท่ากับแบรนด์นำเข้า

โดยใช้พลาสมิดแบบซุปเปอร์คอยล์ที่มีไซต์การจดจำโปรเทโลเมอเรส TelN เป็นแม่แบบ เอนไซม์การเติมแบบไล่ระดับ (0.078-5 U) จาก Yeasen และได้เพิ่มแบรนด์ A พลาสมิดซุปเปอร์คอยล์ 0.5 μg ถูกแปลงเป็นดีเอ็นเอสายคู่เชิงเส้นปิด (dsDNA) การวิเคราะห์ด้วยเจลอิเล็กโทรโฟรีซิสถูกใช้เพื่อตรวจจับประสิทธิภาพการแปลง และผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่ากิจกรรมการตัดและการผูกของ YeasenTelN Protelomerase ของ 's เทียบเท่ากับของแบรนด์ A

รูปที่ 5 การตรวจจับกิจกรรมการแยกโปรเทโลเมอเรสของพลาสมิดควบคุม TelN M:Marker, C: supercoiled

ความสมบูรณ์ของการปิดของ dsDNA เชิงเส้น > 90%

โดยใช้พลาสมิดซุปเปอร์คอยล์ที่มีไซต์การจดจำ TelN Protelomerase เป็นแม่แบบ โดยเพิ่ม TelN Protelomerase ของ Yeasen และแบรนด์ A แปลงพลาสมิดซุปเปอร์คอยล์ 0.5 ไมโครกรัมเป็น dsDNA เชิงเส้นแบบปิด และเติมเอ็กโซนิวคลีเอส T5 เพื่อตรวจจับความสมบูรณ์ของปลายพลาสมิดผ่านระดับการย่อยสลายของแถบ ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าความสมบูรณ์ของการปิดปลายพลาสมิด dsDNA ที่สร้างขึ้นโดย TleN Protelomerase ของ Yeasen คือ > 90% ซึ่งเทียบเท่ากับแบรนด์ A

รูปที่ 6 การทดสอบความสมบูรณ์ของการปิดปลายของเอนไซม์ TelN Protelomerase C1: พลาสมิดที่มีไซต์การจดจำ TelN โดยไม่ใช้เอนไซม์ TelN Protelomerase C2: พลาสมิดที่มีไซต์การจดจำ TelN เอนไซม์ TelN Protelomerase โดยไม่ใช้เอนไซม์เอ็กโซนิวคลีเอส T5 พลาสมิด: พลาสมิดที่มีไซต์การจดจำ TelN

สินค้าที่เกี่ยวข้อง ของ การสังเคราะห์เอนไซม์ DNA

การจำแนกประเภทผลิตภัณฑ์	ชื่อสินค้า	เลขที่แคตตาล็อก
โปรเทโลเมอเรส	เทลเอ็น โปรเทโลเมอเรส (5 หน่วย/ไมโครลิตร)	14540ES
ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส Phi29	phi29 DNA โพลิเมอเรส (10 U/μL)	14404ES
เอ็กโซนิวคลีเอส	เอ็กโซนิวคลีเอส III	14525ES
เอ็กโซนิวคลีเอส	เอ็กโซนิวคลีเอส T5 (10 U/µL)	14538ES
ดีเอ็นทีพี	dNTP มิกซ์ (25 มิลลิโมลาร์ ต่อชิ้น)	10125ES

อาร์การอ้างอิง

[1] จาร์ดินี่ เอ็มเอ, เซกัตโต้ เอ็ม, ดา ซิลวา เอ็มเอส, นูเนส VS, คาโน มิ. เทโลเมียร์ และโปรเทโลเมอเรส ชีววิทยา. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.

[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. DNA ขนาดเล็กแบบปิดเชิงเส้นที่สร้างโดยเอนไซม์ตัด-ต่อแบบโปรคาริโอต TelN ทำหน้าที่ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม J Mol Med (Berl) 2002;80(10):648-654

[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. DNA ขนาดเล็กแบบปิดเชิงเส้นที่สร้างโดยเอนไซม์ตัด-ต่อเชื่อมแบบโพรคาริโอต TelN ทำหน้าที่ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม J Mol Med (Berl) 2002;80(10):648-654 doi:10.1007/s00109-002-0362-2

บทความก่อนหน้า บทความถัดไป