ด้วยการพัฒนาอย่างรวดเร็วของการวิจัยไกลโคโปรตีโอมิกส์และแอนติบอดี การปรับเปลี่ยนไกลโคไซเลชันก็ได้รับความสนใจอย่างมากเช่นกัน การติดต่อระหว่างเซลล์และเซลล์ และระหว่างเซลล์และเชื้อก่อโรคส่วนใหญ่เสร็จสิ้นผ่านปฏิสัมพันธ์ระหว่างน้ำตาลและโปรตีน และไกลโคไซเลชันกำหนดคุณสมบัติการยึดเกาะของไกลโคคอนจูเกต ใน IgG ไกลโคไซเลชันที่เชื่อมโยงกับ N ที่อนุรักษ์ไว้ที่ Asn297 ในบริเวณ Fc ก็มีความสำคัญต่อกิจกรรมของมันเช่นกัน นอกจากนี้ แอนติบอดีบางชนิดยังมี N-ไกลแคนเพิ่มเติม ซึ่งเมื่อรวมกับไซต์อนุรักษ์ไว้ที่ Asn297 ในบริเวณ Fc จะส่งผลต่อการจดจำ ครึ่งชีวิต และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของแอนติบอดี
โปรตีนไกลโคไซเลชันเป็นการดัดแปลงหลังการแปลที่ซับซ้อนซึ่งเกี่ยวข้องกับการเชื่อมต่อของโซ่ไกลแคนที่ตำแหน่งเฉพาะบนโปรตีน ขึ้นอยู่กับประเภทของโซ่ไกลแคน ไกลโคโปรตีนจะแบ่งออกเป็นไกลโคโปรตีนที่เชื่อมกับ N ไกลโคโปรตีนที่เชื่อมกับ O เป็นต้น นอกจากนี้ ไกลโคไซเลชันของโปรตีนยังได้รับผลกระทบจากชนิดเซลล์โฮสต์และสภาวะการหมัก (เช่น อาหารเลี้ยงเชื้อ ค่า pH อุณหภูมิ เป็นต้น) ดังนั้น ไกลโคโปรตีนจึงมักมีความไม่เหมือนกันในรูปแบบไกลโคไซเลชัน รวมถึงตำแหน่งไกลโคไซเลชัน ระดับไกลโคไซเลชัน และโครงสร้างเฉพาะของโซ่ไกลแคน ทำให้การวิเคราะห์โซ่ไกลแคนและลักษณะโครงสร้างเป็นงานที่ท้าทายอย่างยิ่ง เพื่อให้ได้ข้อมูลโครงสร้างโซ่ไกลแคนสูงสุด กลยุทธ์หลักของการวิเคราะห์โซ่ไกลแคนคือ ปลดปล่อยโซ่ไกลแคนออกจากโปรตีนก่อน จากนั้นจึงดำเนินการวิเคราะห์และลักษณะโครงสร้างโดยละเอียด ในกลยุทธ์นี้ วิธีการดีไกลโคไซเลชันที่มีประสิทธิภาพ แม่นยำ และเสถียรจึงมีความสำคัญอย่างยิ่ง
ปัจจุบันมีการใช้วิธีการใช้เอนไซม์อย่างแพร่หลายในการดีไกลโคซิเลชัน
ไกลโคโปรตีนสามารถจำแนกได้เป็นไกลโคเปปไทด์แบบ N-linked และ O-linked โดยพิจารณาจากประเภทของโซ่ไกลแคน สำหรับไกลโคเปปไทด์แบบ N-linked เอนไซม์ที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ เปปไทด์ N-glycosidase F (PNGase F), เอนโดไกลโคซิเดส H (Endo H) และเอนโดไกลโคซิเดส S (Endo S) PNGase F ไฮโดรไลซ์พันธะ GlcNAc-Asn และสามารถกำจัดโซ่ไกลแคนแมนโนสสูง เชิงซ้อน และไฮบริดได้ เอ็นโด H ย่อยพันธะไกลโคซิดิกภายในแกนเพนตาแซ็กคาไรด์ของโซ่ไกลแคน N-glycan ส่วนเอ็นโด S ย่อยไกลแคนที่เชื่อมกับ N โดยเฉพาะจากแกนไคโตไบโอสของโซ่หนักของ IgG ดั้งเดิม
รูปที่ 1. บริเวณการตัดของ PNGase F, Endo H และ Endo S
ในจำนวนนี้ PNGase F เป็นวิธีการใช้เอนไซม์ที่มีประสิทธิผลสูงสุดในการกำจัด N-linked เกือบทั้งหมด โอลิโกแซกคาไรด์ในไกลโคโปรตีน ซึ่งสามารถแยกไกลโคโปรตีนแมนโนสสูง ไฮบริด และเชิงซ้อนที่เชื่อมต่อด้วยแอสพาราจีน โดยเฉพาะอย่างยิ่งการกำจัดไกลแคนที่เชื่อมโยงกับ N บริเวณที่แยกคือ: พันธะอะไมด์ระหว่าง N-acetylglucosamine (GlcNAc) ที่อยู่ด้านในสุดและสารตกค้างของแอสพาราจีน ขณะเดียวกันก็แปลงแอสพาราจีนบนโปรตีนหลังจากการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์เป็นกรดแอสปาร์ติก
เมื่อฟิวโคส α1-6 อยู่ที่แกน GlcNAc, PNGase F ก็สามารถตัดได้เช่นกัน แต่จะไม่สามารถตัดได้ก็ต่อเมื่อฟิวโคส α1-3 อยู่ที่แกน GlcNAc (พบได้ทั่วไปในไกลโคโปรตีนของพืชและแมลง)
อย่างไรก็ตาม ปฏิกิริยาเอนไซม์ PNGase F แบบเดิมต้องใช้เวลาหลายชั่วโมงในการปลดปล่อย N-ไกลแคนของแอนติบอดี และเนื่องจากชอบปลดปล่อยไกลแคน การดีไกลโคซิเลชันที่ไม่สมบูรณ์อาจนำไปสู่ผลลัพธ์ที่ไม่สมดุล และการกระจายไกลแคนที่ได้อาจไม่แสดงองค์ประกอบที่ถูกต้องของแอนติบอดีที่ใช้ในการรักษา ดังนั้น การได้รับโปรไฟล์ N-ไกลแคนที่แม่นยำโดยเร็วที่สุดจึงมีความสำคัญต่อการติดตามการไกลโคซิเลชันในระหว่างกระบวนการผลิตแอนติบอดี โปรตีนฟิวชันแอนติบอดี และตัวแทนทางชีวบำบัดอื่นๆ
PNGase F รวดเร็ว
Fast PNGase F คือรีเอเจนต์รีคอมบิแนนท์ที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมซึ่งสามารถดีไกลโคซิเลตแอนติบอดี อิมมูโนโกลบูลิน โปรตีนฟิวชัน และไกลโคโปรตีนอื่นๆ ได้อย่างรวดเร็วและสมบูรณ์ภายในเวลาเพียงไม่กี่นาที เอนไซม์นี้สามารถกำจัด N-ไกลแคนทั้งหมดได้อย่างรวดเร็วและโดยไม่ต้องเลือก และสามารถใช้โดยตรงสำหรับการวิเคราะห์โครมาโทกราฟีหรือแมสสเปกโตรเมทรีในภายหลัง
คุณสมบัติผลิตภัณฑ์:
เร็ว: การดีไกลโคซิเลชันอย่างสมบูรณ์และรวดเร็วในเวลาเพียงไม่กี่นาที
ความบริสุทธิ์สูง: ไม่มีโปรตีเอส ปนเปื้อนไกลโคซิเดส ความบริสุทธิ์ ≥95%
ไม่เลือก: กำจัด N-glycan ทั้งหมดอย่างรวดเร็วและโดยไม่ต้องเลือก
ความเข้ากันได้ดี: ใช้โดยตรงสำหรับการวิเคราะห์โครมาโทกราฟีปลายทางหรือการวิเคราะห์สเปกโตรเมตรีมวล
ข้อมูลการทดสอบ:
การดีไกลโคซิเลชันโปรตีนแบบขั้นตอนเดียว:
- สารตั้งต้น 10 ไมโครกรัมต่อแอนติบอดี 100 ไมโครกรัม และ ddH2O ผสมกันจนมีปริมาตรรวม 16 ไมโครกรัม
- เติมบัฟเฟอร์ Fast PNGase F จำนวน 4 μL (5x) ปริมาตรสุดท้าย 20 μL
- เติม Fast PNGase F ลงไป 1 μL
- ฟักที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 10 นาที
รูปที่ 2 ผลของการแยกโปรตีนด้วยเอนไซม์แบบขั้นตอนเดียวบนพื้นผิวโปรตีน (A) และแอนติบอดี (B)
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: Competitor + substrate หรือ antibody 3: Competitor + substrate หรือ antibody 4:
การดีไกลโคซิเลชันโปรตีนสองขั้นตอน:
- สารตั้งต้น 10 ไมโครกรัมต่อแอนติบอดี 100 ไมโครกรัม และ ddH2O ผสมกันจนมีปริมาตรรวม 16 ไมโครกรัม
- เติมบัฟเฟอร์ Fast PNGase F จำนวน 4 μL (5x) ปริมาตรสุดท้าย 20 μL
- ฟักที่อุณหภูมิ 80°C เป็นเวลา 2 นาที แล้วปล่อยให้เย็นจนถึงอุณหภูมิห้อง
- เติม Fast PNGase F ลงไป 1 μL
- ฟักที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 10 นาที
รูปที่ 3 ผลการแยกเอนไซม์แบบ 2 ขั้นตอน บนพื้นผิวโปรตีน (A) และแอนติบอดี (B)
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: Competitor + substrate หรือ antibody 3: Competitor + substrate หรือ antibody 4:
บทสรุป:
-
Yeasen PNGase F ที่รวดเร็วมีประสิทธิภาพการแยกเอนไซม์เท่ากันหรือสูงกว่าคู่แข่งที่นำเข้าภายใต้เงื่อนไขปฏิกิริยาเดียวกัน - ขอแนะนำให้ทำการแยกเอนไซม์สองขั้นตอนเพื่อให้การแยกเอนไซม์มีประสิทธิภาพสูงขึ้น แอนติบอดีบางชนิด (เช่น Fab N-glycosylation) ต้องใช้ขั้นตอนการอุ่นล่วงหน้า
เพื่อการดีไกลโคซิเลชันที่มีประสิทธิภาพ
นอกจากนี้,
คำแนะนำในการซื้อ
| หมายเลขผลิตภัณฑ์ | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| ชื่อสินค้า | เร็ว พีเอ็นจีเอส เอฟ | พีเอ็นจีเอส เอฟ | เอ็นโด เอช | เอ็นโด เอส |
| แหล่งที่มา | การแสดงออกของยีสต์รีคอมบิแนนท์ | การแสดงออกของยีสต์รีคอมบิแนนท์ | การแสดงออกของยีสต์รีคอมบิแนนท์ | อีโคไล การแสดงออกแบบรีคอมบิแนนท์ |
| กิจกรรมเฉพาะ | ไม่สามารถใช้งานได้ | 100,000 ยู/มล. | 1000000U/มล. | 8000 ยู/มก. |
| สถานที่แยกร่าง | ไกลแคนที่เชื่อมโยง N เกือบทั้งหมด | ไกลแคนที่เชื่อมโยง N เกือบทั้งหมด | ไกลแคนแมนโนสสูงที่เชื่อมโยงกับ N | แตกออกภายในโครงสร้างไดแซ็กคาไรด์แกนกลางของโซ่หนัก IgG |
| ระยะเวลาการย่อยอาหาร | 10 นาที | 1-3 ชม. | 1-3 ชม. | 1 ชม. |
| ไกลโคซิเลชัน | เหมาะสม | เหมาะสม | เหมาะสม | เหมาะสม |
| โครงสร้างโปรตีน | เหมาะสม | เหมาะสม | เหมาะสม | เหมาะสม |
ข้อมูลการสั่งซื้อ
| ชื่อสินค้า | หมายเลขสินค้า | ข้อมูลจำเพาะ |
| 20406ES20/50 | 20 ตัน/50 ตัน | |
| 20407ES01/02 | 15000 ยู /75000 ยู | |
| 20414ES92/97 | 10000 ยู /50000 ยู | |
| 20413ES80/90 | 1000 ยู/5 x 1000 ยู |