การปนเปื้อนของละอองลอยในสภาพแวดล้อมการปฏิบัติงานเป็นสาเหตุที่พบบ่อยที่สุดของผลลัพธ์บวกปลอมใน PCR: การค้นพบครั้งบุกเบิกของยูราซิลดีเอ็นเอไกลโคซิเลส (UDG) โดยนักวิทยาศาสตร์ชาวอเมริกัน ลินดาห์ล ในเชื้อ E. coli และเชื้อ Bacillus subtilis และการจัดทำระบบป้องกันการปนเปื้อน PCR โดยใช้เอนไซม์ UDG ร่วมกับ dUTP
เอนไซม์ UDG ที่มีจำหน่ายในท้องตลาดประกอบด้วยเอนไซม์ UDG 2 ประเภทหลัก ได้แก่ เอนไซม์ UDG ทั่วไปที่สกัดมาจาก Escherichia coli และ Bacillus subtilis และเอนไซม์ UDG ที่ไม่ทนความร้อนซึ่งสกัดมาจากแบคทีเรียทะเลที่ชอบไซโครฟิลิก เอนไซม์ UDG ทั่วไปมีความทนทานต่อความร้อนสูงกว่า โดยยังคงกิจกรรมยูราซิล-ดีเอ็นเอไกลโคซิเลสในปริมาณเล็กน้อยแม้จะผ่านการบำบัดที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 10 นาที ซึ่งอาจทำให้ผลิตภัณฑ์การขยายเป้าหมายที่มี dU สลายตัว นอกจากนี้ เนื่องจากการใช้สายพันธุ์แบคทีเรียที่ดัดแปลงพันธุกรรม (เช่น E. coli) ในการแสดงออกของเอนไซม์ระดับโมเลกุลแบบรีคอมบิแนนท์ จึงมีดีเอ็นเอจีโนมของโฮสต์ตกค้างอยู่จำนวนหนึ่งในเอนไซม์เหล่านี้ เมื่อรวมกับอิทธิพลของสภาพแวดล้อมการผลิตและแหล่งที่มาของมนุษย์ ผลิตภัณฑ์เอนไซม์ระดับโมเลกุลจึงมีความอ่อนไหวต่อการปนเปื้อนของดีเอ็นเอสูง ในระหว่างการตรวจพบเชื้อก่อโรค DNA ที่ปนเปื้อนอาจจะบดบังกรดนิวคลีอิกเป้าหมายที่มีปริมาณต่ำหรือถูกตรวจพบควบคู่กันไป ซึ่งจะส่งผลต่อการตีความผล
Yeasen UCF.ME ยูราซิลดีเอ็นเอไกลโคซิเลส (UDG/UNG) ไม่ทนต่อความร้อน
คำอธิบาย
UCF.ME Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG) ไม่เสถียรต่อความร้อน 1 U/μL (Cat#14466ES) เอนไซม์ UDG ที่ได้จากแบคทีเรียทะเลที่มีฤทธิ์กัดกร่อน เป็นเอนไซม์ UDG ที่ไม่เสถียรต่อความร้อนที่มีค่าตกค้างต่ำเป็นพิเศษที่เรียกว่า UCF.ME การใช้ผลิตภัณฑ์นี้สามารถป้องกันกิจกรรมตกค้างของเอนไซม์ UDG ทั่วไปหลังจากการทำให้ไม่ทำงานจากการย่อยสลายผลิตภัณฑ์ขยายพันธุ์ที่มี dU ที่อุณหภูมิห้อง นอกจากนี้ยังป้องกันไม่ให้แบคทีเรียพื้นหลังที่มีอยู่ในเอนไซม์ระดับโมเลกุลก่อให้เกิดผลบวกปลอมในผล PCR ดังนั้น การนำเอนไซม์ UDG ที่ไม่เสถียรต่อความร้อนที่มีค่าตกค้างต่ำเป็นพิเศษ UCF.ME® มาใช้จึงมีความสำคัญอย่างยิ่งในการระบุเชื้อก่อโรคติดเชื้อได้อย่างแม่นยำ และช่วยในการวินิจฉัยทางคลินิกของการติดเชื้อและโรคติดเชื้อ
ข้อดีของผลิตภัณฑ์
- สารตกค้างของดีเอ็นเอจีโนม UCF.ME—E. coli ที่ต่ำเป็นพิเศษ <0.1 สำเนา/หน่วย
- ปริมาณนิวคลีเอสตกค้างต่ำ—ไม่มีเอ็กโซนิวคลีเอสตกค้าง เอนไซม์ไนไตรต์ หรือ RNase
- ความสามารถในการย่อยที่แข็งแกร่ง—0.05 U/T สามารถย่อยผลิตภัณฑ์ dU-DNA ได้ 105 สำเนา/T
- การทนความร้อนได้ดี—การทำให้ไม่ทำงานอย่างสมบูรณ์ภายใต้สภาวะใดๆ ก็ตามที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 10 นาที 55°C เป็นเวลา 5 นาที หรือ 95°C เป็นเวลา 5 นาที
- เข้ากันได้กับระบบปฏิกิริยา RT-qPCR—ไม่มีผลกระทบต่อระบบการตรวจจับแม้ในระดับอินพุตสูง (ระบบปฏิกิริยา 2U/20μL)
（1）ความบริสุทธิ์ของโปรตีน≥95%
รูป 1. ผลการตรวจหาความบริสุทธิ์ของโปรตีน (SDS-PAGE)
（2）นิวคลีเอสตกค้างต่ำ: ไม่มีเอ็กโซนิวคลีเอสตกค้าง เอ็นไซม์นิคกิ้ง หรือ RNases
รูป 2. ผลการทดสอบสารตกค้างนิวคลีเอส
（3）ปริมาณดีเอ็นเอตกค้างของ E. coli < 0.1 สำเนา/หน่วย U ปริมาณสารตกค้างต่ำกว่ารีเอเจนต์ทั่วไปอย่างมีนัยสำคัญ
รูป 3. ผลการทดสอบสารตกค้างดีเอ็นเอของอีโคไล
รูป 4. เอนไซม์ UDG เพียง 0.05 U สามารถย่อยผลิตภัณฑ์ dU-DNA ได้ 10^5 สำเนา/T
รูปที่ 5. หลังจากการบำบัดด้วยการทำให้ไม่ทำงานด้วยความร้อน 50℃, 10 นาที; 55℃, 5 นาที; 55℃, 10 นาที; 95℃, 5 นาที ความสามารถในการย่อยอาหารของ 14466ES หายไป
รูปที่ 6 เตรียมส่วนผสม RT-qPCR โดยใช้โพรบไพรเมอร์สองตัวของยีน ORF1ab และ N และ 14466ES เมื่อฉีด 14466ES เข้าไปในระบบปฏิกิริยาในปริมาณ 2U/20μL จะไม่มีการยับยั้ง RT-qPCR ปฏิกิริยา.
คำแนะนำผลิตภัณฑ์ — ซีรี่ส์วัตถุดิบเอนไซม์ PCR ตกค้างต่ำพิเศษ
| การวางตำแหน่งผลิตภัณฑ์ | ชื่อสินค้า | แมว |
| UDG ป้องกันการปนเปื้อน-ทนความร้อน | UCF.ME ยูราซิลดีเอ็นเอไกลโคซิเลส (UDG/UNG) ไม่เสถียรต่อความร้อน 1 U/μL | 14466ES |
| ฮอตสตาร์ต Taq DNA Polymerase | ไฮเอฟ UCF.ME ฮอตสตาร์ท เซนซิทีฟ แทค ดีเอ็นเอ โพลิเมอเรส (5 หน่วย/μL) | 14314ES |
| ทรานสคริปเทสย้อนกลับ | ไฮแฟร์ UCF.ME V รีเวิร์สทรานสคริปเทส (200 U/μL) | 14608ES |
| สารยับยั้ง RNase ของหนู | 14672ES |