ค่า Ct ถือเป็นผลลัพธ์ที่สำคัญในการวิเคราะห์ PCR เชิงปริมาณด้วยฟลูออเรสเซนต์ โดยค่า Ct ใช้เพื่อคำนวณความแตกต่างในระดับการแสดงออกของยีนหรือจำนวนสำเนาของยีน แล้วค่า Ct ช่วงใดจึงจะถือว่าเหมาะสมในการวิเคราะห์เชิงปริมาณด้วยฟลูออเรสเซนต์ เราจะมั่นใจได้อย่างไรว่าค่า Ct อยู่ในช่วงที่มีประสิทธิภาพ วันนี้เราจะให้ Xiao Yi ตอบคำถามนี้ให้กับทุกคน
ค่า Ct คืออะไร?
ในกระบวนการขยายสัญญาณ qPCR ค่า Ct หมายถึงจำนวนรอบการขยายสัญญาณ (Cycle Threshold) ที่สัญญาณฟลูออเรสเซนซ์ของผลิตภัณฑ์ที่ขยายสัญญาณจะไปถึงเกณฑ์ฟลูออเรสเซนซ์ที่กำหนดไว้ "C" ย่อมาจาก Cycle และ "T" ย่อมาจาก Threshold กล่าวอย่างง่ายๆ ค่า Ct คือจำนวนรอบที่เทมเพลตเริ่มต้นใน qPCR ต้องใช้เพื่อให้ถึงปริมาณผลิตภัณฑ์ที่กำหนด ซึ่งจะอธิบายเพิ่มเติมในภายหลัง
ค่า Ct มีหน้าที่อะไร?
1. ความสัมพันธ์ระหว่างการขยายแบบเอ็กซ์โพเนนเชียล ปริมาณเทมเพลต และค่า Ct
ในสถานการณ์ที่เหมาะสม ในระหว่าง qPCR ยีนจะถูกขยายแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลและสะสมกันเป็นจำนวนรอบ ความสัมพันธ์ระหว่างจำนวนรอบการขยายและปริมาณของผลิตภัณฑ์สามารถแสดงได้ดังนี้: ปริมาณของผลิตภัณฑ์ที่ขยาย = ปริมาณเทมเพลตเริ่มต้น×(1 + En)^จำนวนรอบ อย่างไรก็ตาม ปฏิกิริยา qPCR ไม่ได้เกิดขึ้นภายใต้เงื่อนไขที่เหมาะสมเสมอไป เมื่อปริมาณของผลิตภัณฑ์ที่ขยายไปถึง "ปริมาณผลิตภัณฑ์ที่แน่นอน" จำนวนรอบในจุดนี้จะเป็นค่า Ct ซึ่งบ่งบอกถึงช่วงเวลาของการขยายแบบเอ็กซ์โพเนนเชียล ความสัมพันธ์ระหว่างค่า Ct และปริมาณเทมเพลตเริ่มต้นเป็นดังนี้: มีความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่างค่า Ct ของเทมเพลตและลอการิทึมของจำนวนสำเนาเริ่มต้นของเทมเพลตนั้น ความเข้มข้นที่สูงขึ้นของเทมเพลตเริ่มต้นส่งผลให้ค่า Ct ต่ำลง ในขณะที่ความเข้มข้นที่ต่ำกว่าของเทมเพลตเริ่มต้นส่งผลให้ค่า Ct สูงขึ้น
2.เส้นโค้งการขยาย เกณฑ์การเรืองแสง และปริมาณผลิตภัณฑ์ที่แน่นอน
ปริมาณของผลิตภัณฑ์ขยายสัญญาณ qPCR จะแสดงโดยตรงในรูปแบบของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ ซึ่งเรียกว่าเส้นโค้งการขยายสัญญาณ ในระยะเริ่มต้นของ PCR เมื่อการขยายสัญญาณอยู่ภายใต้เงื่อนไขที่เหมาะสมและจำนวนรอบต่ำ การสะสมของผลิตภัณฑ์จะน้อยที่สุด และระดับของฟลูออเรสเซนต์ที่เกิดขึ้นนั้นไม่สามารถแยกแยะได้อย่างชัดเจนจากสัญญาณรบกวนฟลูออเรสเซนต์พื้นหลัง ในเวลาต่อมา การผลิตฟลูออเรสเซนต์จะเข้าสู่ระยะเลขชี้กำลัง ปริมาณผลิตภัณฑ์ PCR สามารถตรวจพบได้ในจุดหนึ่งเมื่อปฏิกิริยาเพิ่งเข้าสู่ระยะเลขชี้กำลัง ซึ่งเรียกว่า "ปริมาณผลิตภัณฑ์ที่แน่นอน" ซึ่งสามารถใช้เพื่ออนุมานเนื้อหาเริ่มต้นของเทมเพลตได้ ดังนั้น ความเข้มของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ที่สอดคล้องกับปริมาณผลิตภัณฑ์ที่แน่นอนจึงเรียกว่าเกณฑ์ฟลูออเรสเซนต์
ในระยะหลังของ PCR กราฟการขยายจะไม่แสดงการขยายแบบเลขชี้กำลังอีกต่อไป และจะเข้าสู่เฟสเชิงเส้นและเฟสราบเรียบ
3.ความสามารถในการทำซ้ำค่า Ct
เมื่อรอบ PCR ครบตามจำนวนรอบที่ค่า Ct เกิดขึ้น ก็จะเข้าสู่ช่วงการขยายแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลที่แท้จริงเท่านั้น ณ จุดนี้ ข้อผิดพลาดเล็กน้อยยังไม่ถูกขยาย ดังนั้น ความสามารถในการทำซ้ำค่า Ct จึงยอดเยี่ยม ซึ่งหมายความว่าไม่ว่าจะขยายเทมเพลตเดียวกันในเวลาต่างกันหรือในหลอดที่แตกต่างกันในเวลาเดียวกัน ค่า Ct ที่ได้จะคงที่
ค่า Ct มีช่วงเท่าไร?
1.ประสิทธิภาพการขยายสัญญาณ
ประสิทธิภาพการขยาย PCR หมายถึงประสิทธิภาพที่โพลีเมอเรสใช้ในการแปลงยีนเป้าหมายให้เป็นผลิตภัณฑ์จากการขยายพันธุ์ประสิทธิภาพในการขยายสัญญาณจะเท่ากับ 100% เมื่อโมเลกุล DNA หนึ่งโมเลกุลถูกแปลงเป็นโมเลกุล DNA สองโมเลกุล ประสิทธิภาพในการขยายสัญญาณโดยทั่วไปจะแสดงเป็น En เพื่อความสะดวกในการวิเคราะห์ในบทความถัดไป ต่อไปนี้เป็นคำอธิบายสั้นๆ เกี่ยวกับปัจจัยที่ส่งผลต่อประสิทธิภาพในการขยายสัญญาณ
| ปัจจัยที่มีอิทธิพล | คำอธิบาย | การตัดสิน |
| ก. สารยับยั้ง PCR | 1. เทมเพลต RNA อาจมีสารที่ยับยั้งปฏิกิริยา PCR เช่น โปรตีนหรือผงซักฟอก เป็นต้น 2. cDNA ที่ได้หลังการถอดรหัสย้อนกลับอาจประกอบด้วยเทมเพลต RNA ในปริมาณสูง และส่วนประกอบของรีเอเจนต์ถอดรหัสย้อนกลับ ซึ่งอาจยับยั้ง PCR ในภายหลังได้ด้วย | 1. สามารถประเมินการมีอยู่ของการปนเปื้อนได้โดยการวัดอัตราส่วน A260/A280 และ A260/A230 หรือโดยการทำอิเล็กโทรโฟรีซิส RNA 2. หลังจากการถอดรหัสย้อนกลับ ไม่ว่า cDNA จะถูกเจือจางในสัดส่วนที่แน่นอนหรือไม่ |
| B. การออกแบบไพรเมอร์ที่ไม่สมเหตุสมผล | ไพรเมอร์ไม่สามารถอบได้อย่างมีประสิทธิภาพ | ตรวจสอบว่ามีไดเมอร์หรือโครงสร้างกิ๊บติดผมในไพรเมอร์หรือไม่ และหากมีความไม่ตรงกัน บางครั้งจำเป็นต้องใส่ใจกับการออกแบบอินทรอนที่ครอบคลุม |
| C.ขั้นตอนการตอบสนองที่ไม่เหมาะสม | 1. ไพรเมอร์ไม่สามารถอบได้อย่างมีประสิทธิภาพ 2. กิจกรรมของ DNA โพลิเมอเรสไม่ถูกปล่อยออกมาอย่างสมบูรณ์ 3. เนื่องจากอุณหภูมิที่สูงเป็นเวลานาน ทำให้กิจกรรมของ DNA โพลิเมอเรสลดลง | 1. อุณหภูมิการอบอ่อนสูงกว่าค่า Tm ของไพรเมอร์ 2. ระยะเวลาก่อนการทำลายธรรมชาติสั้นเกินไป 3. ระยะเวลาในแต่ละขั้นตอนในโปรโตคอลปฏิกิริยานานเกินไป |
| D. สารเคมีไม่ผสมเข้ากันอย่างทั่วถึงหรือการปิเปตผิดพลาด | ในระบบปฏิกิริยา ความเข้มข้นในท้องถิ่นของส่วนประกอบปฏิกิริยา PCR สูงเกินไปหรือไม่สม่ำเสมอ ส่งผลให้การขยายตัวของ PCR แบบไม่เลขชี้กำลัง | - |
| E.ความยาวของแอมพลิคอน | ความยาวของแอมพลิคอนยาวเกินไป เกิน 300 คู่เบส ส่งผลให้ประสิทธิภาพในการขยายสัญญาณต่ำ | ตรวจสอบว่าความยาวของแอมพลิคอนอยู่ระหว่าง 80 คู่เบสถึง 300 คู่เบสหรือไม่ |
| F.ผลกระทบของรีเอเจนต์ qPCR | ความเข้มข้นของ DNA โพลิเมอเรสที่ต่ำลงในรีเอเจนต์หรือความเข้มข้นของไอออนที่ไม่เหมาะสมในบัฟเฟอร์ส่งผลให้เอนไซม์ Taq ไม่สามารถทำงานได้ถึงขีดสุด | กราฟมาตรฐานใช้ในการวัดประสิทธิภาพการขยายของไพรเมอร์ |
2.ช่วงค่า Ct
ค่า Ct อยู่ในช่วง 15-35 โดยค่า Ct ที่น้อยกว่า 15 ถือว่าอยู่ในช่วงพื้นฐานและยังไม่ถึงเกณฑ์การเรืองแสง โดยหลักการแล้ว ความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่างค่า Ct กับลอการิทึมของจำนวนสำเนาเริ่มต้นของเทมเพลต ซึ่งเรียกว่าเส้นโค้งมาตรฐาน เมื่อใช้เส้นโค้งมาตรฐาน เมื่อประสิทธิภาพการขยายสัญญาณอยู่ที่ 100% ค่า Ct สำหรับการวัดปริมาณสำเนาเดี่ยวของยีนจะคำนวณได้ประมาณ 35 หากค่า Ct มากกว่า 35 ตามทฤษฎีแล้ว จำนวนสำเนาเริ่มต้นของเทมเพลตจะน้อยกว่า 1 ซึ่งถือว่าไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ
สำหรับยีนที่แตกต่างกัน ช่วงค่า Ct ซึ่งเกิดจากการเปลี่ยนแปลงในปริมาณเทมเพลตเริ่มต้นของสำเนายีนและประสิทธิภาพการขยายพันธุ์ จำเป็นต้องสร้างกราฟมาตรฐานสำหรับยีนนั้นเพื่อคำนวณช่วงการตรวจจับเชิงเส้นของยีน
3.ปัจจัยที่มีผลต่อค่า Ct
จากความสัมพันธ์ระหว่างจำนวนรอบการขยายสัญญาณและปริมาณผลิตภัณฑ์ จะเห็นได้ว่าปริมาณผลิตภัณฑ์การขยายสัญญาณ = ปริมาณเทมเพลตเริ่มต้น × (1 + En)^จำนวนรอบสัญญาณ ภายใต้เงื่อนไขที่เหมาะสม ปริมาณเทมเพลตเริ่มต้นและ En จะส่งผลกระทบต่อค่า Ct ความแตกต่างในคุณภาพเทมเพลตหรือประสิทธิภาพการขยายสัญญาณอาจทำให้ค่า Ct สูงหรือต่ำเกินไป
4. ค่า Ct สูงหรือต่ำเกินไป
เสี่ยวอี้ปรึกษากับผู้เชี่ยวชาญในแผนกเทคนิคของบริษัทเราและสรุปสาเหตุและวิธีแก้ไขปัญหาทั่วไปสองประเภทกับค่า Ct เพื่อให้ผู้อ่านของเราได้รับความรู้
| ปัญหา | สาเหตุ | โซลูชั่น |
| ค่าซีทีสูงเกินไป | ความเข้มข้นของเทมเพลตต่ำหรือมีสารยับยั้ง PCR อยู่ ประสิทธิภาพในการขยายต่ำ | 1. เพิ่มความเข้มข้นของเทมเพลต หรือเพิ่มอัตราส่วนการเจือจางของ RNA หรือ cDNA หรือเตรียมเทมเพลตใหม่อีกครั้ง 2. ลดอุณหภูมิการอบอ่อน หรือใช้การขยายสองขั้นตอน ตรวจสอบให้แน่ใจว่าส่วนประกอบและระบบผสมกันอย่างทั่วถึง เพิ่มประสิทธิภาพโปรโตคอลปฏิกิริยา หรือลองเปลี่ยนสารเคมี |
| ค่าซีทีต่ำเกินไป | 1. ความเข้มข้นของเทมเพลตสูง 2. การปนเปื้อนใน NTC (ไม่มีการควบคุมเทมเพลต) และ NRC (ไม่มีการควบคุมย้อนกลับ) 3. การออกแบบไพรเมอร์ที่ไม่เหมาะสม | 1. ลดปริมาณเทมเพลต RNA หรือเจือจาง cDNA ในอัตราส่วนที่สูงขึ้น 2. เปลี่ยนสารเคมีทั้งหมดใหม่ หรือใช้สารเคมีป้องกันการปนเปื้อน UDGase 3. ปรับปรุงขั้นตอนการทำงานเพื่อหลีกเลี่ยงการขยายสัญญาณที่ไม่เฉพาะเจาะจง |
การวิเคราะห์ค่า Ct ที่ผิดปกติเป็นสาเหตุของปัญหานี้ถือเป็นการสรุป ต่อไป Xiao Yi จะแนะนำผลิตภัณฑ์คุ้มราคาหลากหลายชนิดเพื่อให้แน่ใจว่าข้อมูลการทดลองของคุณแม่นยำและเชื่อถือได้มากขึ้น มาเลือกผลิตภัณฑ์ที่คุณชอบกันเถอะ!
| ชื่อสินค้า | แมว# | ขนาด |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 มล. |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix สำหรับ qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 ตัน |
| Hifair™ AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix สำหรับ qPCR | 11151ES60 | 100 ตัน |
| ชุดสังเคราะห์ cDNA Hifair™ AdvanceFast 1st Strand (ไม่มีสีย้อม) | 11150ES60 | 100 ตัน |