qPCR (fluorescent quantitative PCR) เป็นเทคนิคที่ใช้กันทั่วไปในห้องปฏิบัติการ ซึ่งสามารถนำไปใช้ในการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน การกำหนดจีโนไทป์ การตรวจหาเชื้อก่อโรค การวิเคราะห์ SNP และอื่นๆ อีกมากมาย การทำงานของ qPCR นั้นง่ายดาย และหลักการก็เข้าใจง่าย ในปัจจุบัน เมื่อต้องเผชิญกับข้อมูลจำนวนมากที่ยุ่งเหยิง วิธีการวิเคราะห์ผลลัพธ์จึงกลายเป็นงานที่น่าปวดหัว วันนี้ Xiao Yi จะแนะนำคุณเกี่ยวกับวิธีลดความซับซ้อนของกระบวนการและรับข้อมูลที่สามารถเผยแพร่ในวารสาร SCI ได้อย่างง่ายดาย!
วิธีการวิเคราะห์ทั่วไปที่ใช้ใน qPCR ได้แก่ การหาปริมาณสัมพันธ์และการหาปริมาณสัมบูรณ์ และการเลือกใช้ระหว่างวิธีการเหล่านี้ควรขึ้นอยู่กับการออกแบบการทดลองที่แตกต่างกัน ในฉบับนี้ เราจะเน้นที่การประยุกต์ใช้ qPCR ทั่วไป ซึ่งได้แก่ การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน โดยวิธีการหาปริมาณสัมพันธ์มักจะได้รับการเลือกใช้
การออกแบบการทดลอง
สมมติว่าขณะนี้เราต้องศึกษาผลของการเหนี่ยวนำด้วยแสงต่อการแสดงออกของยีน Arabidopsis AtSUC2 กลุ่มควบคุมจะประกอบด้วยพืช Arabidopsis ที่ไม่ได้รับการรักษาใดๆ ในขณะที่กลุ่มทดลองจะประกอบด้วยพืชที่ได้รับการรักษาด้วยแสงเหนี่ยวนำ RNA จะถูกสกัดจากทั้งสองกลุ่มและถอดรหัสย้อนกลับเพื่อให้ได้ cDNA ซึ่งจะถูกใช้เป็นแม่แบบ ยีน GAPDH ของ Arabidopsis จะถูกเลือกเป็นข้อมูลอ้างอิงภายในสำหรับการทดลอง qPCR
หลุม qPCR ที่ต้องตั้งค่ามีดังนี้:
1) กทช. (ไม่มีการควบคุมเทมเพลต) ใช้เพื่อตรวจสอบว่ามีการปนเปื้อนในระบบ PCR หรือไม่
2) นรท. (ไม่มีการถอดรหัสย้อนกลับ) หมายถึงการใช้ RNA ที่ไม่ได้ผ่านการถอดรหัสย้อนกลับเป็นแม่แบบ ซึ่งทำหน้าที่เป็นการควบคุมการปนเปื้อนของ gDNA
3) การ ยีนอ้างอิงภายใน ใช้เพื่อแก้ไขความแตกต่างที่เกิดจากความเข้มข้นเริ่มต้นของตัวอย่างที่แตกต่างกัน
4) การคัดเลือก ตัวอย่างการควบคุม โดยทั่วไปจะอยู่ในประเภทต่อไปนี้:
- ในการประเมินผลของการบำบัดบางอย่างต่อการแสดงออกของยีน จะใช้ตัวอย่างที่ไม่ได้รับการรักษาเป็นตัวอย่างอ้างอิง
- เพื่อตรวจจับความแตกต่างในการแสดงออกของยีนในเวลาต่างๆ จะใช้ตัวอย่างในเวลา 0 เป็นตัวอย่างอ้างอิง
- เพื่อเปรียบเทียบความแตกต่างในการแสดงออกของยีนในเนื้อเยื่อต่าง ๆ จะเลือกเนื้อเยื่อหนึ่งตัวอย่างโดยสุ่มเพื่อเป็นตัวอย่างอ้างอิง
สิ่งหนึ่งที่ควรทราบที่นี่คือ สำหรับวัสดุแต่ละชนิดที่กล่าวถึงข้างต้น ได้มีการตั้งหลุม PCR จำนวน 3 หลุม (1, 2, 3) หลุมเหล่านี้คือหลุมจำลอง PCR หรือเรียกอีกอย่างว่าหลุมจำลองทางเทคนิค ซึ่งมีจุดประสงค์เพื่อขจัดข้อผิดพลาดในการทำงานและประเมินประสิทธิภาพการขยายพันธุ์อย่างแม่นยำ นอกจากนี้ ยังจำเป็นต้องจัดตั้งหลุมจำลองทางชีวภาพ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการทดลองเดียวกันกับวัสดุที่แตกต่างกัน (เวลาที่แตกต่างกัน พืช ชุด เพลตปฏิกิริยา) เพื่อปรับเทียบความแปรปรวนทางชีวภาพและวิเคราะห์ว่าการบำบัดมีความสำคัญทางสถิติหรือไม่ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีนี้ ทั้งกลุ่มทดลองและกลุ่มควบคุมต้องการตัวอย่าง Arabidopsis อย่างน้อยอีกสองชุด (A, B, C) เพื่อประมวลผล RNA จะถูกสกัดจากแต่ละชุดและถอดรหัสย้อนกลับ ตามด้วย qPCR สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ จะใช้ค่าเฉลี่ยของหลุมจำลองทางชีวภาพทั้งสาม
การวิเคราะห์ผลลัพธ์ — วิธี ΔΔCt
ลักษณะเฉพาะของวิธี ΔΔCt คืออาศัยค่า Ct เท่านั้นในการคำนวณ แต่หลักการคือประสิทธิภาพการขยายของยีนเป้าหมายและยีนอ้างอิงจะต้องค่อนข้างสม่ำเสมอ และทั้งสองอย่างจะอยู่ในช่วง 90-110%
สูตรการคำนวณเฉพาะมีดังนี้:
ΔCt = Ct (ยีนเป้าหมาย) - Ct (ยีนอ้างอิง)
ΔΔCt = ΔCt (กลุ่มทดลอง) - ΔCt (กลุ่มควบคุม)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
โดยถือว่าการทดลองข้างต้นศึกษาผลของการเหนี่ยวนำแสงต่อการแสดงออกของยีน Arabidopsis AtSUC2 ผลลัพธ์ของ qPCR เป็นดังนี้:
ในการคำนวณ เราจะคำนวณค่าเฉลี่ยของข้อมูล 2^-△Ct ของกลุ่มควบคุมก่อน (ดังที่แสดงในรูปด้านบน ซึ่งคือ 0.00116) จากนั้น เราจะหารค่า 2^-△Ct แต่ละค่าด้วยค่าเฉลี่ยนี้เพื่อให้ได้ค่า 2^-△△Ct ในที่สุด เราจะจัดระเบียบค่าเหล่านี้เพื่อให้ได้ค่าเฉลี่ยและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน ซึ่งบ่งชี้ว่าระดับการแสดงออกของยีนเป้าหมายในกลุ่มทดลองเพิ่มขึ้นประมาณ 9.73 เท่าเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม
ผลลัพธ์จะถูกพล็อตโดยใช้ซอฟต์แวร์ Graphpad ดังต่อไปนี้:
ค่า P ที่คำนวณโดยใช้การทดสอบ t ของซอฟต์แวร์คือ 0.0024 ซึ่งน้อยกว่า 0.05 แสดงให้เห็นถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติ และผลลัพธ์มีความน่าเชื่อถือ
การวิเคราะห์ผลลัพธ์ — วิธีเส้นโค้งมาตรฐานคู่
ในการใช้งานจริง เนื่องจากประสิทธิภาพการขยายของยีนเป้าหมายและยีนอ้างอิงมักจะแตกต่างกัน จึงจำเป็นต้องออกแบบไพรเมอร์ใหม่และปรับเงื่อนไขปฏิกิริยาให้เหมาะสมเพื่อให้ได้ประสิทธิภาพการขยายเท่ากัน อย่างไรก็ตาม เราสามารถเลือกวิธีที่สะดวกกว่าได้ นั่นคือแนวทางเส้นโค้งมาตรฐานคู่
ก่อนอื่นเรามาทำความเข้าใจวิธีการวิเคราะห์เชิงปริมาณสัมบูรณ์กันก่อน ขั้นตอนเฉพาะคือ ขยายชิ้นส่วนเป้าหมายผ่าน PCR จากนั้นใส่ชิ้นส่วนเป้าหมายลงในเวกเตอร์โคลน สกัดพลาสมิดรีคอมบิแนนท์ และหลังจากการจัดลำดับยืนยันว่าถูกต้องแล้ว ก็สามารถใช้เป็นมาตรฐานได้ ปริมาณดีเอ็นเอพลาสมิดสามารถวัดได้โดยใช้เครื่องมือ เช่น Nanodrop จากนั้นแปลงจำนวนสำเนาเป็นสำเนาพลาสมิดเฉพาะโดยใช้สูตรแปลงจำนวนสำเนา หลังจากนั้น ขยายดีเอ็นเอตามการเจือจางชุดหนึ่ง กราฟมาตรฐานจะถูกวาดโดยใช้ลอการิทึมของจำนวนสำเนามาตรฐานเป็นแกน x และค่า Ct ที่วัดได้เป็นแกน y โดยอิงจากค่า Ct ของตัวอย่างที่ไม่ทราบค่า จึงสามารถคำนวณจำนวนสำเนาสัมบูรณ์ได้
สูตรคำนวณจำนวนสำเนา:
จำนวนสำเนา = (มวล ÷ มวลโมเลกุลสัมพันธ์) × 6.02 × 10^23
วิธีการเส้นโค้งมาตรฐานคู่เกี่ยวข้องกับการสร้างตัวอย่างมาตรฐานแยกกันสำหรับยีนเป้าหมายและยีนอ้างอิง การดำเนินการวัดปริมาณแบบสัมบูรณ์ และการสร้างเส้นโค้งมาตรฐาน หลังจากคำนวณจำนวนสำเนาสัมบูรณ์ของตัวอย่างที่ไม่รู้จักแล้ว จะมีการเปรียบเทียบ ซึ่งจะทำให้มีความแม่นยำสูงขึ้น
สูตรการคำนวณเฉพาะมีดังนี้:
Q = จำนวนสำเนาของยีนเป้าหมาย / จำนวนสำเนาของยีนอ้างอิง
RQ = Q (ทดลอง) / Q (ควบคุม)
ในการทดลองที่กล่าวถึงข้างต้น ซึ่งศึกษาผลของการเหนี่ยวนำแสงต่อการแสดงออกของยีน Arabidopsis AtSUC2 ได้มีการสร้างตัวอย่างมาตรฐานสำหรับทั้ง AtSUC2 และ GAPDH และเตรียมเส้นโค้งมาตรฐานต่อไปนี้:
ค่า Ct สำหรับยีนเป้าหมายและยีนอ้างอิงภายในในตัวอย่างที่ต้องทดสอบมีดังนี้:
ระหว่างการคำนวณ ขั้นแรก ค่า Ct ของยีนเป้าหมายและยีนอ้างอิงภายในจะถูกแทนที่ในความสัมพันธ์เชิงเส้นของเส้นโค้งมาตรฐานเพื่อให้ได้จำนวนสำเนาสัมบูรณ์ของยีนเป้าหมายและยีนอ้างอิงภายในในกลุ่มทดลองและกลุ่มควบคุม จากนั้น โดยใช้สูตร Q = จำนวนสำเนาของยีนเป้าหมาย / จำนวนสำเนาของยีนอ้างอิง ระดับการแสดงออกของยีนเป้าหมายจะได้รับการทำให้เป็นมาตรฐานสุดท้าย ตามสูตร RQ = Q (ทดลอง) / Q (ควบคุม) คำนวณ RQ ได้ 9.71 ซึ่งบ่งชี้ว่าระดับการแสดงออกของยีนเป้าหมายในกลุ่มทดลองสูงกว่าในกลุ่มควบคุม 9.71 เท่า
ผลลัพธ์จะถูกพล็อตโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad ดังต่อไปนี้:
ค่า P ที่คำนวณโดยใช้การทดสอบ t ของซอฟต์แวร์คือ 0.0008 ซึ่งน้อยกว่า 0.05 แสดงให้เห็นถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติ และผลลัพธ์มีความน่าเชื่อถือ
การวิเคราะห์ข้อมูล qPCR สำหรับเซสชันนี้เสร็จสิ้นแล้ว ต่อไป ฉันจะแนะนำผลิตภัณฑ์คุ้มราคาหลากหลายชนิดเพื่อให้แน่ใจว่าข้อมูลการทดลองของคุณแม่นยำและเชื่อถือได้มากขึ้น มาเลือกซื้อกันได้เลย!
| ชื่อสินค้า | แมว# | ขนาด |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 มล. |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix สำหรับ qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 ตัน |
| Hifair™ AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix สำหรับ qPCR | 11151ES60 | 100 ตัน |
| ชุดสังเคราะห์ cDNA Hifair™ AdvanceFast 1st Strand (ไม่มีสีย้อม) | 11150ES60 | 100 ตัน |