ทำงานตามทั้งสองสาย การวิเคราะห์การแสดงออกของ miRNA ง่ายขึ้น

ความยาวของไมโครอาร์เอ็นเอที่โตเต็มที่อยู่ที่ประมาณ 20nt โดยปกติแล้วไพรเมอร์ด้านหน้าจะครอบคลุมความยาวทั้งหมดของไมโครอาร์เอ็นเอหรืออาจมีส่วนเกินด้วยซ้ำ และไพรเมอร์ด้านหลังจะไม่มีที่ว่างให้วาง วิธีแก้ปัญหาในตลาดปัจจุบันคือการเพิ่มความยาวของทรานสคริปต์ด้านหลังระหว่างการถอดรหัสย้อนกลับ วิธีการทั่วไป ได้แก่ วิธีการหางและวิธีสเต็มลูป

1. บทนำ
2. ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ
3. รายการสินค้าที่เกี่ยวข้อง

1. บทนำ

ไมโครอาร์เอ็นเอ (miRNA) คืออาร์เอ็นเอสายเดี่ยวขนาดเล็กที่มีขนาดประมาณ 21-23 เบส ซึ่งสร้างขึ้นจากสารตั้งต้นของอาร์เอ็นเอสายเดี่ยวที่มีโครงสร้างแบบกิ๊บติดผมประมาณ 70-90 เบสหลังจากการประมวลผลเอนไซม์ไดเซอร์ ไมโครอาร์เอ็นเอจับกับบริเวณที่ไม่เข้ารหัสปลาย 3' ของ mRNA ของยีนเป้าหมายโดยเฉพาะ และควบคุมกระบวนการแปลของ mRNA ของยีนเป้าหมายหลังการถอดรหัส จึงขัดขวางการแปลของ mRNA และส่งเสริมการย่อยสลายของ mRNA ส่งผลให้การแสดงออกของโปรตีนลดลง บทบาทของไมโครอาร์เอ็นเอเกี่ยวข้องกับการเกิดและการพัฒนาของโรคหัวใจและหลอดเลือดต่างๆ เช่น การเกิด การแบ่งตัวของเนื้อเยื่อ การแพร่กระจายของเซลล์ และอะพอพโทซิส

Figure 1. Schematic diagram of miRNA synthesis in vivo

รูปที่ 1 แผนผังของการสังเคราะห์ miRNA ในร่างกาย

Figure 2. miRNA synthesis by tailing method

รูปที่ 2 การสังเคราะห์ miRNA โดยวิธี tailing

Figure 3. miRNA synthesis by the stem-loop method

รูปที่ 3 การสังเคราะห์ miRNA โดยวิธีสเต็มลูป

วิธีการแยกส่วนใช้โพลีเอโพลีเมอเรสเพื่อเพิ่มส่วนหางโพลี(เอ) ให้กับไมโครอาร์เอ็นเอที่โตเต็มที่ และใช้โอลิโก-ดีทีกับลำดับสากลเป็นไพรเมอร์การถอดรหัสย้อนกลับเพื่อสังเคราะห์ไมโครอาร์เอ็นเอที่ยาวขึ้นซึ่งสอดคล้องกับสายแรกของ cDNA วิธีการสเต็มลูปใช้ลำดับสากลที่พับเข้าในโครงสร้างสเต็มลูปเป็นไพรเมอร์เพื่อสังเคราะห์สายแรกของ cDNA ที่สอดคล้องกับไมโครอาร์เอ็นเอที่ยาวขึ้น โครงสร้างสเต็มลูปจะเปิดออกที่อุณหภูมิที่เหมาะสมในระหว่างกระบวนการขยายพันธุ์ในภายหลัง และใช้ร่วมกับไพรเมอร์ขยายที่เกี่ยวข้อง

ตารางที่ 1.การเปรียบเทียบระหว่างการต่อหางและสเต็มลูป

หมวดหมู่	การหาง	สเต็มลูป
ความสามารถในการนำไปใช้	เหมาะสำหรับการศึกษาไมโครอาร์เอ็นเอหลายตัวพร้อมกัน	เหมาะสำหรับการตรวจจับปริมาณที่แม่นยำของไมโครอาร์เอ็นเอจำนวนเล็กน้อยในตัวอย่าง
ข้อได้เปรียบ	การถอดรหัสย้อนกลับเพียงครั้งเดียวสามารถตรวจจับไมโครอาร์เอ็นเอได้หลายตัวด้วยปริมาณงานสูง	สามารถตรวจพบไมโครอาร์เอ็นเอได้ครั้งละหนึ่งตัวเท่านั้นโดยการถอดรหัสย้อนกลับ โดยมีความจำเพาะที่แข็งแกร่ง
ระบบ	ร่วมกับ miRNA ที่เกี่ยวข้อง การถอดรหัสย้อนกลับในระบบปฏิกิริยาเดียวกันด้วยความแม่นยำสูง	ไมโครอาร์เอ็นเอที่เกี่ยวข้องภายในจะถูกแยกและถอดรหัสย้อนกลับในสองระบบ ซึ่งมีแนวโน้มที่จะเกิดข้อผิดพลาด
ความเฉพาะเจาะจง
ความไวต่อความรู้สึก
เวลา

2. ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำ

2.1 Yeasen การผสมผสานเชิงปริมาณการกลับหางของ miRNA (11148ES&11171ES)

Figure 4. 11148ES-Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

รูปที่ 4 ชุดสังเคราะห์ cDNA 1st Strand ของ miRNA รุ่น 11148ES-Hifair™

ชุดทดสอบนี้ใช้หลักการหางเพื่อย้อนกลับการถอดรหัสของ cDNA สายแรกของ miRNA บัฟเฟอร์ RT miRNA 2×Hifair™ ในผลิตภัณฑ์ประกอบด้วยวัตถุดิบและไพรเมอร์ทั้งหมดสำหรับปฏิกิริยาหาง miRNA และปฏิกิริยาการถอดรหัสย้อนกลับ และได้รับการปรับแต่งอย่างพิถีพิถัน ช่วยให้มั่นใจได้ว่ากระบวนการดัดแปลงโพลี(A) และการถอดรหัสย้อนกลับของปลาย 3' ของ miRNA ดำเนินไปอย่างมีประสิทธิภาพพร้อมกัน

Figure 5. 11171ES -Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

รูปที่ 5. 11171ES -Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

รีเอเจนต์ตรวจจับฟลูออเรสเซนต์เชิงปริมาณแบบผสมล่วงหน้ารุ่นใหม่ที่พัฒนาขึ้นเป็นพิเศษสำหรับการตรวจจับเชิงปริมาณด้วยไมโครอาร์เอ็นเอ ซึ่งประกอบด้วยสีย้อมอ้างอิงแบบพาสซีฟ ROX พิเศษ เหมาะสำหรับเครื่องมือ qPCR ทั้งหมด ไม่จำเป็นต้องปรับความเข้มข้นของ ROX บนเครื่องมือต่างๆ เพียงแค่ในปฏิกิริยาการเตรียม การขยายสามารถทำได้โดยการเพิ่มไพรเมอร์และเทมเพลตลงในระบบ โพลิเมอเรสของดีเอ็นเอใช้โพลิเมอเรสแบบฮอตสตาร์ทที่ดัดแปลงทางเคมี และทำงานร่วมกับระบบบัฟเฟอร์พิเศษ ซึ่งทำให้ปฏิกิริยามีความจำเพาะและความไวสูงขึ้น และสามารถวัดปริมาณได้อย่างแม่นยำในช่วงที่กว้างขึ้น

2.2 ประสิทธิภาพของสินค้า

2.2.1 เข้ากันได้กับเครื่องมือ qPCR ทุกแพลตฟอร์ม

Figure 6. Compatible results with different qPCR instruments

รูปที่ 6 ผลลัพธ์ที่เข้ากันได้กับเครื่องมือ qPCR ที่แตกต่างกัน

การใช้ Total RNA ของเซลล์ 293T เป็นเทมเพลต ดำเนินการถอดรหัสย้อนกลับโดยใช้ Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)cDNA ที่ได้จะถูกเจือจาง 10 เท่า แล้วใช้ Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) เพื่อตรวจหายีนอ้างอิงภายในของ hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p และ U6 ตามลำดับ

2.2.2 อัตราการตรวจจับสูงถึง 10 pg

Figure 7. Amplification plot

รูปที่ 7 กราฟการขยาย

Figure 8. Amplification plot

รูปที่ 8 กราฟการขยาย

การใช้ hsa-miR-let-7e-5p(a) สังเคราะห์และเซลล์ 293T Total RNA(b) เป็นแม่แบบ โดยเจือจางเป็นระดับไล่ระดับต่อไปนี้ ตามลำดับ: สำเนา 60 ถึง 606 สำเนา (ระดับไล่ระดับ 6) และ pg-100 ng 10 (ระดับไล่ระดับ 5) ถอดรหัสย้อนกลับด้วย Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) และตรวจพบ cDNA ที่ได้โดยใช้ Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) สำหรับการแสดงออกของยีน hsa-miR-let-7e -5p

2.2.3 มีความจำเพาะสูง สามารถแยกแยะความแตกต่างของเบสเดี่ยวระหว่างไมโครอาร์เอ็นเอในตระกูลเดียวกันได้

Figure 9. Distinguish single base differences between miRNAs

รูปที่ 9 แยกแยะความแตกต่างของเบสเดี่ยวระหว่างไมโครอาร์เอ็นเอ

ครอบครัว hsa-let-7 ของมนุษย์มีไมโครอาร์เอ็นเอหลายตัว โดยมีเบสเพียงไม่กี่ตัวที่แตกต่างกัน หรือแม้แต่เบสที่แตกต่างกันเพียงตัวเดียว ไมโครอาร์เอ็นเอสังเคราะห์สำหรับแต่ละไอโซฟอร์ม Let-7 (hsa-miR-let-7a~Let-7i, has-miR-98) จะถูกถอดรหัสย้อนกลับเป็น cDNA โดยใช้ชุดสังเคราะห์ Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA (Cat# 11148ES) โดยใช้ Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) เพื่อขยายไมโครอาร์เอ็นเอเหล่านี้แยกกันโดยใช้ไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน และคำนวณอัตราการจับคู่โดยใช้สมการ 2-ΔCT x 100% ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าสามารถแยกแยะสมาชิกในกลุ่มย่อยที่เกี่ยวข้องกันอย่างใกล้ชิดได้อย่างมีประสิทธิภาพ

2.2.4 ประสิทธิภาพการขยายที่ยอดเยี่ยม

Figure 10. Amplification efficiency

รูปที่ 10 ประสิทธิภาพการขยายสัญญาณ

Figure 11. Amplification efficiency

รูปที่ 11 ประสิทธิภาพการขยายสัญญาณ

ยีน miR-let-7b-5p, miR-let-7c-5p, miR-let-7e-5p, miR-let-7f-5p ได้รับการขยายโดยใช้เซลล์ 293T ของมนุษย์และ RNA ทั้งหมดของตับหนูเป็นแม่แบบ ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าเมื่อเปรียบเทียบกับผลิตภัณฑ์ที่คล้ายคลึงกัน ชุดสังเคราะห์ cDNA Hifair™ miRNA 1st Strand (Cat# 11148ES) มีประสิทธิภาพที่ยอดเยี่ยมเทียบเท่ากับระบบปฏิกิริยาของ Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)

2.2.5 เสถียรภาพดีเยี่ยม

Figure 12. Product stability analysis at 37℃ for 7 days

รูปที่ 12 การวิเคราะห์เสถียรภาพของผลิตภัณฑ์ที่อุณหภูมิ 37℃ เป็นเวลา 7 วัน

Figure 13. Analysis of results after 50 freeze-thaw cycles

รูปที่ 13 การวิเคราะห์ผลลัพธ์หลังจากการแช่แข็งและละลายน้ำแข็ง 50 รอบ

Figure 14. Stable analytical properties of the quantitative reaction system at different temperatures for 24h

รูปที่ 14 คุณสมบัติการวิเคราะห์ที่เสถียรของระบบปฏิกิริยาเชิงปริมาณที่อุณหภูมิต่างกันเป็นเวลา 24 ชั่วโมง

การถอดรหัสย้อนกลับดำเนินการโดยใช้ Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) โดยใช้ 293T cell Total RNA เป็นแม่แบบ และ cDNA ที่ได้จะถูกเจือจาง 10 เท่าและตรวจพบด้วย Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) การแสดงออกของ hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p, hsa-miR-let-7e-5p △Ct<0.5

2.3 Yeasen การผสมผสานเชิงปริมาณการกลับด้านของสเต็มลูปของ miRNA (11139ES&11170ES)

Figure 15. 11139ES-Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

รูปที่ 15 ชุดสังเคราะห์ cDNA 1st Strand รุ่น 11139ES-Hifair™ III (gDNA digester plus)

ชุดนี้ได้รับการพัฒนาโดยใช้ Hifair™ III Reverse Transcriptaseความเร็วในการสังเคราะห์ cDNA ของเอนไซม์นั้นรวดเร็ว และความเสถียรของความร้อนก็ได้รับการปรับปรุงอย่างมาก ในเวลาเดียวกัน เอนไซม์ยังช่วยเพิ่มความสัมพันธ์กับเทมเพลตและเหมาะสำหรับการถอดรหัสย้อนกลับของเทมเพลตจำนวนเล็กน้อยและยีนที่มีสำเนาน้อย ความสามารถของ Hifair™ III Reverse Transcriptase ในการสังเคราะห์ cDNA ที่มีความยาวเต็มยังได้รับการปรับปรุงอีกด้วย ทำให้สามารถสังเคราะห์ cDNA ได้สูงสุดถึง 19.8 kb

Figure 16. 11170ES-Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

รูปที่ 16 11170ES-Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

ผลิตภัณฑ์นี้เป็นมาสเตอร์มิกซ์พิเศษสำหรับการวัดปริมาณไมโครอาร์เอ็นเอโดยใช้วิธีไคเมอริกฟลูออเรสเซนซ์ SYBR Green I เนื่องจากลำดับไมโครอาร์เอ็นเอสั้นและลำดับไมโครอาร์เอ็นเอในตระกูลเดียวกันมักจะมีความคล้ายคลึงกันมาก จึงจำเป็นต้องมีความจำเพาะอย่างยิ่งในระหว่างการวัดปริมาณ ผลิตภัณฑ์นี้ใช้ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสแบบฮอตสตาร์ทพร้อมบัฟเฟอร์ที่ปรับให้เหมาะสมซึ่งสามารถลดการขยายแบบไม่จำเพาะได้อย่างมาก ในขณะเดียวกัน สีย้อมอ้างอิง ROX พิเศษทำให้มาสเตอร์มิกซ์เหมาะสำหรับเครื่องมือ qPCR ทั้งหมด และไม่จำเป็นต้องปรับ ROX ในเครื่องมืออื่น การขยายสามารถทำได้โดยการเติมไพรเมอร์และเทมเพลตเมื่อเตรียมระบบปฏิกิริยา

2.3.1 เข้ากันได้กับเครื่องมือ qPCR ทุกแพลตฟอร์ม

Figure 17. Compatible results with different qPCR instruments

รูปที่ 17 ผลลัพธ์ที่เข้ากันได้กับเครื่องมือ qPCR ที่แตกต่างกัน

การใช้ RNA ทั้งหมดของเซลล์ตับของหนูเป็นแม่แบบ ดำเนินการถอดรหัสย้อนกลับด้วย Hifair™ III 1st Strand
ชุดสังเคราะห์ cDNA (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES) จากนั้นเจือจาง cDNA ที่ได้ 40 เท่า และใช้ Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) เพื่อขยายยีน mmu-miR-125a ของมนุษย์ตามลำดับ

2.3.2 ความไวสูงถึง 10 pg

Figure 18. Sensitivity detection

รูปที่ 18 การตรวจจับความไว

การใช้ RNA ทั้งหมดของเซลล์ตับของหนูเป็นแม่แบบ ดำเนินการถอดรหัสย้อนกลับโดยใช้ Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES) จากนั้นเจือจาง cDNA ที่ได้ตามลำดับ 10 เท่า (ช่วง 10pg/μL) -0.1 μg/μL) ขยายยีน mmu-miR-125a, mmu-miR-132 และ mmu-miR-351 ที่มีต้นกำเนิดจากหนู

2.3.3 มีความจำเพาะสูง สามารถแยกแยะความแตกต่างของเบสเดี่ยวระหว่างไมโครอาร์เอ็นเอในตระกูลเดียวกันได้

รูปที่ 19 แยกแยะความแตกต่างของเบสเดี่ยวระหว่างไมโครอาร์เอ็นเอ

ครอบครัว hsa-let-7 ของมนุษย์มีไมโครอาร์เอ็นเอหลายตัว โดยมีเบสเพียงไม่กี่ตัวที่แตกต่างกัน หรือแม้แต่เบสที่แตกต่างกันเพียงตัวเดียว ไมโครอาร์เอ็นเอเหล่านี้ได้รับการขยายแยกกันด้วยไพรเมอร์ที่แตกต่างกันโดยใช้ Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) และอัตราการจับคู่คำนวณโดยใช้สูตร 2^-Δct x 100%

2.3.4 ความสามารถในการทำซ้ำได้ดี

Figure 20. Repeatability detection

รูปที่ 20 การตรวจจับการทำซ้ำ

การใช้ Total RNA ของเซลล์ 293T ของมนุษย์เป็นแม่แบบสำหรับการถอดรหัสย้อนกลับ โดยทำการถอดรหัสย้อนกลับโดยใช้ Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES) จากนั้นเจือจาง cDNA ที่ได้ 50 เท่า และใช้ Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) เพื่อขยายยีน hsa-let-7a ของมนุษย์ในการทดลองจำลอง 90 หลุม

2.3.5 เสถียรภาพที่ดี

Figure 21. Stability analysis of 11170ES at different temperatures for 14 days

รูปที่ 21.การวิเคราะห์เสถียรภาพของ 11170ES ที่อุณหภูมิต่างกันเป็นเวลา 14 วัน

Figure 22. Analysis of 11170ES repeated freezing and thawing

รูปที่ 22 การวิเคราะห์การแช่แข็งและละลายซ้ำของ 11170ES

Figure 23. Stable analysis properties of the quantitative reaction system at different temperatures for 24h

รูปที่ 23 คุณสมบัติการวิเคราะห์เสถียรของระบบปฏิกิริยาเชิงปริมาณที่อุณหภูมิต่างกันเป็นเวลา 24 ชั่วโมง

RNA ทั้งหมดของเซลล์ตับของหนูถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับการถอดรหัสย้อนกลับด้วยชุดสังเคราะห์ cDNA Hifair™ III 1st Strand (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES) cDNA ที่ได้จะถูกเจือจาง 100 เท่าเพื่อขยายยีน mmu- miR-132 ของหนู

3. รายการสินค้าที่เกี่ยวข้อง

Yeasen บริษัท ไบโอเทคโนโลยี (เซี่ยงไฮ้) จำกัด ก่อตั้งขึ้นในปี 2014 เป็นองค์กรด้านเทคโนโลยีขั้นสูงที่ดำเนินการด้านการวิจัยและพัฒนาและการผลิตวัตถุดิบเอนไซม์สำหรับเครื่องมือและแอนติบอดีแอนติเจน ผลิตภัณฑ์ของบริษัทได้แก่ เอนไซม์สำหรับการวินิจฉัยระดับโมเลกุล โปรตีน และแอนติบอดีที่ใช้ในอุตสาหกรรมยา การทดสอบความปลอดภัยของอาหาร การเพาะพันธุ์ ความยุติธรรม และอุตสาหกรรมอื่นๆ เรามุ่งมั่นที่จะมอบผลิตภัณฑ์และบริการคุณภาพสูงให้กับลูกค้าในสาขาวิทยาศาสตร์ชีวภาพ ผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้องที่จัดทำโดย Yeasen มีดังนี้:

ตารางที่ 2 รายการสินค้าที่เกี่ยวข้อง

ประเภทวิธีการ	ขั้นตอนการทดลอง	ชื่อสินค้า	รหัสสินค้า
การหาง	การถอดเสียงย้อนกลับ	ไฮแฟร์™ ชุดสังเคราะห์ cDNA ของ miRNA 1st Strand	11148ES
การหาง	คิวพีซีอาร์	ไฮฟ์™ miRNA ยูนิเวอร์แซล qPCR SYBR มาสเตอร์มิกซ์	11171ES
สเต็มลูป	การถอดเสียงย้อนกลับ	ไฮแฟร์™ ชุดสังเคราะห์ cDNA III 1st Strand (gDNA digester plus) -สอบถามเพิ่มเติม-	11139ES
สเต็มลูป	คิวพีซีอาร์	ไฮฟ์™ miRNA ยูนิเวอร์แซล qPCR SYBR มาสเตอร์มิกซ์ (สอบถามเพิ่มเติม-	11170ES

บทความก่อนหน้า บทความถัดไป

ทำงานตลอดทั้งสองบรรทัดการวิเคราะห์การแสดงออกของ miRNA ทำได้ง่ายขึ้น