ความสำเร็จที่ก้าวล้ำจาก Yeasen และชีวเทคโนโลยีโมเลกุลในอนาคต
ด้วยการพัฒนาอย่างรวดเร็วของเทคโนโลยีชีวภาพ การบำบัดด้วย mRNA จึงกลายเป็นวิธีการรักษาใหม่ที่น่าสนใจ เนื่องจากสามารถเขียนโปรแกรมได้อย่างมีประสิทธิภาพและตอบสนองได้รวดเร็ว ในสาขาต่างๆ เช่น วัคซีน mRNA และยีนบำบัด การสังเคราะห์ mRNA คุณภาพสูงอย่างมีประสิทธิภาพถือเป็นขั้นตอนสำคัญในการบรรลุเป้าหมายการรักษา ในกระบวนการนี้ โพลิเมอเรสของ RNA ของ T7 มีบทบาทสำคัญ เนื่องจากสามารถเร่งปฏิกิริยาการสังเคราะห์ mRNA ในหลอดทดลองได้อย่างมีประสิทธิภาพ
ปัญหาผลพลอยได้ dsRNA ของโพลีเมอเรส T7 RNA
แม้ว่า T7 RNA polymerase จะมีบทบาทสำคัญในการสังเคราะห์ mRNA แต่การทำงานจริงมักส่งผลให้เกิดการผลิต double-stranded RNA (dsRNA) เป็นผลพลอยได้ การมีอยู่ของ dsRNA ไม่เพียงแต่ลดปริมาณผลผลิตและความบริสุทธิ์ของ mRNA เท่านั้น แต่ยังอาจกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันแบบไม่จำเพาะ ซึ่งส่งผลต่อประสิทธิภาพและความปลอดภัย ดังนั้น การลดการผลิต dsRNA จึงกลายเป็นความต้องการเร่งด่วนในอุตสาหกรรม ปัจจุบัน วิธีการลดปริมาณ dsRNA ส่วนใหญ่ได้แก่ การปรับสภาพปฏิกิริยาให้เหมาะสมและการใช้เอนไซม์เสริม แม้ว่าวิธีการเหล่านี้จะสามารถลดปริมาณการผลิต dsRNA ได้ในระดับหนึ่ง แต่บ่อยครั้งก็มีปัญหา เช่น การดำเนินการที่ซับซ้อนและต้นทุนที่เพิ่มขึ้น
เหตุใดเราจึงต้องทำวิศวกรรม RNA โพลิเมอเรส T7?
การปรับเปลี่ยนโพลีเมอเรส T7 RNA โดยตรงเพื่อลดการผลิต dsRNA เป็นวิธีแก้ปัญหาพื้นฐานกว่า เทคนิควิวัฒนาการที่ควบคุมด้วยเอนไซม์สามารถปรับปรุงคุณสมบัติการเร่งปฏิกิริยาและเพิ่มความบริสุทธิ์และผลผลิตของผลิตภัณฑ์ได้โดยการเปลี่ยนลำดับกรดอะมิโนหรือโครงสร้างของเอนไซม์อย่างแม่นยำ สำหรับโพลีเมอเรส T7 RNA การดัดแปลงที่กำหนดเป้าหมายไม่เพียงแต่จะลดการผลิต dsRNA เท่านั้น แต่ยังเพิ่มประสิทธิภาพโดยรวมและคุณภาพของการสังเคราะห์ mRNA อีกด้วย
ในฐานะผู้จัดหาสารตั้งต้นในการสังเคราะห์ mRNA ในหลอดทดลอง
dsRNA เกิดขึ้นได้อย่างไร?
ตามรายงานวรรณกรรม การผลิต dsRNA ซึ่งเป็นผลพลอยได้ส่วนใหญ่มีต้นกำเนิดมาจากสองแหล่ง (รูปที่ 1): แหล่งแรกคือในช่วงการเปลี่ยนผ่านของโพลีเมอเรส T7 RNA จากโครงร่างเริ่มต้นไปเป็นโครงร่างขยาย ในระยะเริ่มต้นของการถอดรหัส คอมเพล็กซ์เทอร์นารีของการถอดรหัสมีแนวโน้มที่จะแตกตัว [1] ส่งผลให้มีโซ่ RNA สั้นจำนวนมาก (RNA ที่ไม่ทำงาน) ที่มีความยาวประมาณ 20 nt หลุดออกมาในระบบ โซ่ RNA เหล่านี้ทำหน้าที่เป็น "ไพรเมอร์" จับคู่เสริมกับโซ่ RNA ยาว และขยายออกเพื่อผลิต dsRNA ภายใต้การทำงานของกิจกรรมโพลีเมอเรส RNA ที่ขึ้นอยู่กับ RNA ของโพลีเมอเรส T7 RNA (กิจกรรม RDRP) [2,3] แหล่งที่สองถูกกระตุ้นโดยกิจกรรมการถ่ายโอนไรโบนิวคลีโอไทด์ที่ปลายสุดซึ่งมีอยู่ในโพลีเมอเรส T7 RNA เมื่อปฏิกิริยาการถอดรหัสไปถึงปลายเทมเพลตเชิงเส้น โพลีเมอเรส T7 RNA อาจเพิ่มไรโบนิวคลีโอไทด์หลายตัวแบบสุ่มโดยไม่ขึ้นอยู่กับเทมเพลต ไรโบนิวคลีโอไทด์เหล่านี้ซึ่งก่อตัวเป็น "ไพรเมอร์แบบสุ่ม" อาจพับกลับและจับคู่กันอย่างเสริมกันกับบริเวณ mRNA เป้าหมาย ขยายออกเพื่อผลิต dsRNA dsRNA ที่ผลิตขึ้นโดยการวนซ้ำเรียกว่า dsRNA แบบวนซ้ำ [3,4] ดังนั้น เพื่อลดผลพลอยได้ของ dsRNA จุดเน้นของการดัดแปลงโพลีเมอเรสของ RNA T7 จึงอยู่ที่การทำให้คอมเพล็กซ์เทอร์นารีการถอดรหัสในระยะเริ่มต้นมีเสถียรภาพ หรือการทำให้กิจกรรมการถ่ายโอนปลายสุดและโพลีเมอเรสของ RNA ที่ขึ้นอยู่กับ RNA (RDRP) อ่อนแอลง กิจกรรมของเอนไซม์ RNA polymerase T7
รูปที่ 1 แผนผังของหลักการกั้นพลังงานและการสร้าง dsRNA (ข้อมูลที่ไม่ได้เผยแพร่)
วิธีการเอาชนะ อุปสรรคด้านพลังงาน ของเอนไซม์ RNA โพลิเมอเรส T7 การเปลี่ยนผ่านตามโครงร่าง-
จากการวิเคราะห์โครงสร้างและพลังงานอิสระ ทีมงานได้ค้นพบว่าควบคู่ไปกับการเปลี่ยนแปลงของโครงร่างของโพลีเมอเรสอาร์เอ็นเอ T7 ยังมีการเปลี่ยนแปลงของพลังงานด้วย พลังงานอิสระของโครงร่างการต่อขยายนั้นสูงกว่าโครงร่างการเริ่มต้นอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ว่ากระบวนการถอดรหัสจำเป็นต้องเอาชนะอุปสรรคด้านพลังงานที่สูงกว่าเพื่อผลิตโซ่ mRNA ที่สมบูรณ์ อุปสรรคด้านพลังงานที่สูงนั้นไม่เอื้อต่อการเปลี่ยนผ่านโครงร่างอย่างราบรื่น ดังนั้น ทีมงานจึงใช้ มีเหตุผล วิธีการคัดกรองเพื่อระบุกรดอะมิโนจุดสำคัญมากกว่า 20 ชนิดและสร้างไลบรารีการกลายพันธุ์แบบอิ่มตัวที่สอดคล้องกัน
วิธีการปรับเปลี่ยน การถ่ายโอนปลายสายและกิจกรรม RDRP ของโพลีเมอเรส RNA T7
ในทางกลับกัน หากพิจารณาจากรายงานที่จำกัดเกี่ยวกับฟังก์ชัน ไซต์ และโดเมนโครงสร้างที่เกี่ยวข้องกับการถ่ายโอนปลายทางและกิจกรรม RDRP ของโพลีเมอเรส RNA ของ T7 และเนื่องจากกิจกรรมทั้งสองนี้ซึ่งมีหน้าที่คล้ายกัน มีแนวโน้มที่จะแบ่งปันไซต์หลักกับปฏิกิริยาหลักของโพลีเมอเรส RNA ของ T7 ซึ่งก็คือกิจกรรมการถอดรหัส (เช่น กิจกรรมโพลีเมอไรเซชันของ RNA ที่ขึ้นอยู่กับ DNA หรือ DDRP) จึงยากที่จะค้นหากรดอะมิโนฮอตสปอตสำหรับการดัดแปลงที่กำหนดเป้าหมายที่ตำแหน่ง ดังนั้น ทีมจึงได้สร้างไลบรารีการกลายพันธุ์แบบสุ่มหลายไลบรารีพร้อมกันโดยอิงจาก PCR ที่มีข้อผิดพลาดได้ง่าย ร่วมกับความสามารถในการวิวัฒนาการปริมาณมากของแพลตฟอร์ม ZymeEditor ส่งผลให้ความหลากหลายเกิน 10^6 สำหรับไลบรารีแต่ละรายการ
การค้นพบอุดมคติโดยอาศัยโพรบ โพลิเมอเรสอาร์เอ็นเอ T7
เพื่อสร้างสมดุลให้กับการผลิตโพลีเมอเรสของ RNA T7 และตรวจติดตามเนื้อหาของ dsRNA ในปฏิกิริยาการถอดรหัสในหลอดทดลอง ทีมงานได้ออกแบบฟลูออเรสเซนต์หลายตัวโดยอ้างอิงจากเทมเพลตการถอดรหัสที่เหมาะสมที่สุดอย่างพิถีพิถัน โพรบที่กำหนดเป้าหมายบริเวณต่างๆ ของผลิตภัณฑ์ mRNA เป้าหมาย โพรบเหล่านี้เชื่อมโยงข้อมูล เช่น ผลผลิตของปฏิกิริยา ความสมบูรณ์ และเนื้อหาของ dsRNA ภายในระบบกับสัญญาณการเรืองแสง ยิ่งความเข้มของการเรืองแสงของระบบมีมากเท่าใด ประสิทธิภาพการทำงานของมิวแทนต์ก็จะยิ่งดีขึ้นเท่านั้น ในทางทฤษฎี วิธีการคัดกรองนี้สามารถจัดอันดับมิวแทนต์โดยอิงตามความเข้มของการเรืองแสงของโพรบต่างๆ โดยได้มิวแทนต์ T7 RNA polymerase ที่มีผลผลิตสูงหรือ RNA ที่ล้มเหลวลดลง รวมถึงมิวแทนต์ที่มีความสมบูรณ์ที่ดีขึ้นหรือ dsRNA loopback ที่ลดลง เมื่อเทมเพลตปฏิกิริยาถูกแทนที่ด้วย RNA มิวแทนต์ที่มีกิจกรรม RDRP ที่ลดลงก็สามารถคัดกรองในเชิงลบได้เช่นกัน ซึ่งช่วยปรับปรุงการเลือกเทมเพลตของโพลีเมอเรส T7 RNA นอกจากนี้ การเพิ่มนิวคลีโอไทด์ที่ดัดแปลง อนาล็อกแคป และการเพิ่มอุณหภูมิปฏิกิริยาในระบบปฏิกิริยาหยด สามารถดำเนินการคัดกรองเพิ่มเติมเพื่อเลือกมิวแทนต์ T7 RNA polymerase ที่ทนต่อสารตั้งต้นที่ไม่ใช่ธรรมชาติและแสดงความเสถียรทางความร้อนที่ดีขึ้น
วิธีการคัดกรองที่ดีที่สุด โพลิเมอเรสอาร์เอ็นเอ T7-
โดยพิจารณาจากขนาดของห้องสมุด ทีมงาน พัฒนาขั้นตอนคัดกรองปริมาณงานสูงพิเศษโดยอาศัยการคัดแยกหยดของเหลวที่กระตุ้นด้วยฟลูออเรสเซนต์ (FADS) และขั้นตอนคัดกรองปริมาณงานสูงโดยอาศัยวิธีไมโครเพลทแบบดั้งเดิม (MTPS)จากการทดลองหลายรอบ พบว่ามีมิวแทนต์มากกว่า 10^7 ตัวที่ถูกคัดกรอง ส่งผลให้มิวแทนต์หลายตัวมีปริมาณ dsRNA ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ในจำนวนนี้ มิวแทนต์บางตัวมีปริมาณ dsRNA ลดลงอันเนื่องมาจาก RNA ที่ไม่ทำงานในระหว่างปฏิกิริยา ซึ่งบ่งชี้ว่าโครงสร้างการต่อขยายของมิวแทนต์โพลีเมอเรสเหล่านี้มีความเสถียรมากขึ้น มิวแทนต์บางตัวมีปริมาณ dsRNA แบบลูปแบ็กลดลงในระหว่างปฏิกิริยา ซึ่งบ่งชี้ว่ากิจกรรมการถ่ายโอนปลายสุดหรือกิจกรรม RDRP ในมิวแทนต์เหล่านี้อ่อนลง
เนื่องจากข้อได้เปรียบด้านประสิทธิภาพของสารกลายพันธุ์ที่กล่าวถึงข้างต้นเกิดจากกลไกที่แตกต่างกัน ทีมงานจึง ได้สร้างไลบรารีการสับเปลี่ยน DNA ที่กำหนดเป้าหมายไว้ หลังจากทำการคัดกรองแล้ว ทีมงาน ในที่สุดก็ได้กลายพันธุ์ที่มีประสิทธิภาพเหนือกว่า โดยการสร้าง dsRNA ต่ำมากในขณะที่ไม่ส่งผลกระทบต่อผลผลิตและความสมบูรณ์ของ mRNA (รูปที่ 2) อย่างไรก็ตาม ผลผลิตของยีนกลายพันธุ์ G47A+884G ที่ค้นพบโดย Moderna ได้รับผลกระทบ[5] (ไม่ได้เผยแพร่)
รูปที่ 2 กระบวนการวิวัฒนาการเอนไซม์และลักษณะเฉพาะของการทำงานของกลายพันธุ์
(ไม่เผยแพร่)
การวิเคราะห์การสร้าง dsRNA โดย โพลิเมอเรสอาร์เอ็นเอ T7 ตัวแปร?
หลังจากการวิเคราะห์เชิงปริมาณ ดังที่แสดงในรูปที่ 3 โดยใช้เทมเพลตการถอดรหัส 9 kb ภายใต้เงื่อนไขการปิดการถอดรหัสร่วม โพลิเมอเรส RNA ชนิดป่า T7 ผลิต dsRNA ได้ประมาณ 2.9 ng/μg เมื่อใช้นิวคลีโอไทด์ธรรมชาติ ในขณะที่เทมเพลตเชิงพาณิชย์ เอนไซม์ T7 ผลิต dsRNA ได้ประมาณ 0.18 ng/μg อย่างไรก็ตาม การผลิต dsRNA ของ T7 RNA polymerase variant แต่ละตัว สร้างขึ้นน้อยกว่า 0.10 ng/μg โดยเฉพาะอย่างยิ่งหนึ่ง ตัวแปร มีค่าเพียง 0.015 ng/μg ต่ำกว่าชนิดป่าเกือบ 200 เท่า และต่ำกว่าชนิดเชิงพาณิชย์ถึง 12 เท่า ผลิตภัณฑ์ หลังจากการทดสอบซ้ำแล้วซ้ำเล่า ข้อได้เปรียบด้านประสิทธิภาพของตัวแปรในการลด dsRNA ได้รับการสังเกตอย่างสม่ำเสมอภายใต้เงื่อนไขปฏิกิริยาที่แตกต่างกัน ซึ่งบ่งชี้ถึงความเข้ากันได้ของระบบที่ดีของกลายพันธุ์เหล่านี้ และวางรากฐานสำหรับการลดการผลิต dsRNA เพิ่มเติมผ่านบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา การเพิ่มประสิทธิภาพ นอกจากนี้ การคัดกรอง FADS ยังได้รับตัวแปรหลายตัวที่มีความสมบูรณ์ของผลิตภัณฑ์และเสถียรภาพทางความร้อนที่ดีขึ้น ซึ่งสามารถตอบสนองความต้องการของแอปพลิเคชันการถอดรหัสในหลอดทดลองที่หลากหลายยิ่งขึ้น
รูปที่ 3 การประเมินการสร้าง dsRNA โดยตัวแปรโพลิเมอร์ RNA T7 ที่ประเมินโดยใช้
ในปัจจุบันพันธมิตรหลายรายได้ทดลองใช้ตัวแปร T7 RNA polymerase แล้ว และเราได้รับคำชมเชยอย่างสูงจากพวกเขา การใช้เอนไซม์ใหม่ทำให้ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ของ mRNA ง่ายขึ้น เพิ่มประสิทธิภาพในการทำงาน และแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพที่โดดเด่นในสถานการณ์การใช้งานที่หลากหลาย
เกี่ยวกับ Molefuture Biotechnology
Molefuture Biotechnology เป็นบริษัทในเครือของ
ข้อมูลการสั่งซื้อ
ต่อไปนี้เป็นผลิตภัณฑ์ตัวแทนที่นำเสนอโดย
ในส่วนของการอ่าน:
การแบ่งปันรายงานการตรวจสอบความถูกต้องของชุดทดสอบ ELISA dsRNA เพื่อส่งเสริมการมาตรฐานการตรวจจับ dsRNA
อ้างอิง: