คุณกำลังมองหาวิธีที่เชื่อถือได้ในการตรวจหา dsRNA ที่เหลือระหว่างการถอดรหัส mRNA ในหลอดทดลองหรือไม่? ไม่ต้องมองหาที่ไหนไกลไปกว่าชุดทดสอบ ELISA ของ Double-stranded RNA (dsRNA) อย่างไรก็ตาม เนื่องจากมีชุดทดสอบเชิงพาณิชย์หลายชุดที่วางจำหน่าย จึงควรทราบว่าข้อมูลการตรวจสอบอาจไม่เปิดเผยต่อสาธารณะเสมอไป ส่งผลให้การตรวจจับ dsRNA ไม่สอดคล้องกัน นั่นเป็นเหตุผลที่เราแบ่งปันรายงานการตรวจสอบความถูกต้องของชุดทดสอบ ELISA ของ Double-stranded RNA (dsRNA) ซึ่งครอบคลุมถึงความจำเพาะ ความแม่นยำ ความถูกต้อง ความไว และความทนทาน รายงานนี้ทำหน้าที่เป็นคู่มืออ้างอิงเพื่อตรวจสอบความถูกต้องของวิธีการตรวจจับ dsRNA ที่เหลือซึ่งปรับให้เหมาะกับสภาวะการทดลองเฉพาะและมาตรฐานเภสัชตำรับที่ควบคุม โปรดเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับรายงานการตรวจสอบความถูกต้องของเรา เพื่อส่งเสริมการมาตรฐานการตรวจหา dsRNA
การวิเคราะห์ ELISA โดยใช้ dsRNA แบบสองสาย เคมัน
พื้นหลัง:
ชุดทดสอบ ELISA ของ dsRNA แบบสองสายเป็นชุดทดสอบรีเอเจนต์ที่ออกแบบมาเพื่อตรวจจับ dsRNA ที่เหลือซึ่งผลิตขึ้นระหว่างกระบวนการถอดรหัส mRNA ในหลอดทดลอง โดยใช้หลักการทดลองของการทดสอบ ELISA แบบแซนวิชแอนติบอดีคู่ และระบบขยายไบโอติน-สเตรปตาวิดิน ชุดทดสอบนี้จึงสามารถตรวจจับ dsRNA ที่เหลือในตัวอย่างได้อย่างละเอียดอ่อน
ข้อมูลสรุปประกอบด้วยพารามิเตอร์การตรวจสอบที่ครอบคลุมถึงความจำเพาะ ความแม่นยำ ความถูกต้อง ความไว และความทนทาน รายงานนี้ทำหน้าที่เป็นคู่มืออ้างอิงที่กระตุ้นให้ผู้ใช้ตรวจสอบวิธีการตรวจจับสารตกค้างของ dsRNA ที่ปรับให้เหมาะกับสภาพการทดลองเฉพาะของตนและปฏิบัติตามมาตรฐานเภสัชตำรับที่ควบคุม
วัสดุและวิธีการ:
ชุด: ชุดทดสอบ ELISA RNA สายคู่ (dsRNA): Cat#36717ES (
วิธีการ: วัสดุและขั้นตอนการดำเนินการที่จำเป็นสำหรับการทดลองนั้นระบุไว้เป็นหลักโดย
ผลลัพธ์
- ความเป็นเส้นตรงของมาตรฐาน dsRNA
รายงานนี้ได้พัฒนากราฟมาตรฐานสำหรับมาตรฐาน dsRNA ทั้งสี่ประเภทที่แตกต่างกัน โดยแต่ละประเภทมีความยาว 300bp มาตรฐานเหล่านี้ได้แก่ STD1 คือ dsRNA ที่ไม่ได้ดัดแปลง STD2 คือ dsRNA ที่ดัดแปลงโดย Pseudo-UTP STD3 คือ dsRNA ที่ดัดแปลงโดย N1-Me-Pseudo-UTP และ STD4 คือ dsRNA ที่ดัดแปลงโดย 5-OMe-UTP มาตรฐาน dsRNA แต่ละประเภทมีความเป็นเส้นตรงของการเจือจางที่ยอดเยี่ยม โดยมี R2 > 0.99 และค่าสัมประสิทธิ์การแปรผัน (CV) ของความเข้มข้นที่วัดได้น้อยกว่า 10% ตามที่แสดงในตารางที่ 1 ถึงตารางที่ 5
| ชื่อโรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์ | ประเภท UTP | ความเป็นเส้นตรงของการเจือจาง (ร20.99) | ซีวี |
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์1 | ยูทีพี | 0.0156-1 pg/ μL | 10% |
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์ชนิดที่ 2 | พียูทีพี | 0.0156-1 pg/μL | 10% |
| STD3 | N1-Me-พีทีพี | 0.0312-1 pg/μL | 10% |
| STD4 | 5-OMe-ยูทีพี | 0.0625-1 พิกกรัม/ไมโครลิตร | 10% |
ตารางที่ 1 ความเป็นเส้นตรงของมาตรฐาน dsRNA ที่แตกต่างกัน
| STD1 ความเข้มข้นน- -พิกกรัมต่อไมโครลิตร- | ค่าเฉลี่ยที่วัดได้ -พิกกรัมต่อไมโครลิตร- | การกู้คืน | ซีวี |
| 1 | 1.0001 | 100.0% | 3.1% |
| 0.5 | 0.4994 | 99.9% | 2.4% |
| 0.25 | 0.2516 | 100.7% | 3.3% |
| 0.125 | 0.1227 | 98.1% | 0.5% |
| 0.0625 | 0.0640 | 102.5% | 3.2% |
| 0.0312 | 0.0309 | 99.2% | 1.3% |
| 0.0156 | 0.0157 | 100.4% | 3.2% |
| 0 | - | - | - |
ตารางที่ 2.การฟื้นตัวและ CV ของ STD1 เจือจาง
| STD2 เข้มข้นน- -พิกกรัมต่อไมโครลิตร- | ค่าเฉลี่ยที่วัดได้ -พิกกรัมต่อไมโครลิตร- | การกู้คืน | ซีวี |
| 1 | 1.0001 | 100.0% | 0.7% |
| 0.5 | 0.4994 | 99.9% | 0.1% |
| 0.25 | 0.2514 | 100.6% | 0.9% |
| 0.125 | 0.1232 | 98.6% | 2.5% |
| 0.0625 | 0.0635 | 101.6% | 1.1% |
| 0.0312 | 0.0312 | 99.9% | 0.5% |
| 0.0156 | 0.0155 | 99.6% | 0.0% |
| 0 | - | - | - |
ตารางที่ 3. การกู้คืนและ CV ของ STD2 เจือจาง
| ความเข้มข้น STD3 -พิกกรัมต่อไมโครลิตร- | ค่าเฉลี่ยที่วัดได้ -พิกกรัมต่อไมโครลิตร- | การกู้คืน | ซีวี |
| 2 | 2.0031 | 100.2% | 1.6% |
| 1 | 0.9880 | 98.8% | 2.4% |
| 0.5 | 0.5188 | 103.8% | 1.2% |
| 0.25 | 0.2383 | 95.3% | 2.2% |
| 0.125 | 0.1242 | 99.4% | 0.1% |
| 0.0625 | 0.0629 | 100.7% | 1.8% |
| 0.0312 | 0.0361 | 115.7% | 1.6% |
| 0 | - | - | - |
ตารางที่ 4. การกู้คืนและ CV ของ STD3 เจือจาง
| ความเข้มข้น STD4 -พิกกรัมต่อไมโครลิตร- | ค่าเฉลี่ยที่วัดได้ -พิกกรัมต่อไมโครลิตร- | การกู้คืน | ซีวี |
| 4 | 4.0096 | 100.2% | 1.9% |
| 2 | 1.9940 | 99.7% | 0.7% |
| 1 | 0.9977 | 99.8% | 0.1% |
| 0.5 | 0.5108 | 102.2% | 0.1% |
| 0.25 | 0.2454 | 98.2% | 5.6% |
| 0.125 | 0.1207 | 96.5% | 2.8% |
| 0.0625 | 0.0624 | 99.9% | 0.3% |
| 0 | - | - | - |
ตารางที่ 5. การกู้คืนและ CV ของ STD4 เจือจาง
-
ความเฉพาะเจาะจง
- การวิเคราะห์ความจำเพาะด้วย dsRNA, ssRNA, dsDNA และ ssDNA
- ความจำเพาะไม่ได้รับผลกระทบจากความยาวของ dsRNA
-
เอความแม่นยำ
การเพิ่ม 0.5 pg/μL ของ STD1 การวิเคราะห์ตัวอย่าง mRNA ที่ทราบแล้วซึ่งมีปริมาณ dsRNA 0.36 pg/μL ดำเนินการในอัตราส่วนปริมาตรสามแบบ (1:1, 1:20, 1:250) ในทุกกรณี อัตราการฟื้นตัวของสไปก์จะอยู่ในช่วง 80-120%
อัตราการฟื้นตัวของ Spike คำนวณได้ดังนี้: Spike การกู้คืน อัตรา=(วัด ความเข้มข้น หลังจาก สไปค์×รวม ปริมาณ ของ มีหนามแหลม ตัวอย่าง-วัดได้ ความเข้มข้น ของ เดอะ ตัวอย่าง×รวม ปริมาณ ของ เดอะ ตัวอย่าง)/(เชิงทฤษฎี ความเข้มข้น ของ เดอะ สไปค์×ปริมาณ ของ เดอะ สไปค์)×100%
| ตัวอย่าง | อัตราส่วนปริมาตรของ STD1/ตัวอย่าง | วัดค่า dsRNA (พีจี/ไมโครลิตร) | สไปค์ การกู้คืน ประเมิน |
| ตัวอย่าง (TS) | - | 0.36 | - |
| TS+0.5pg/ไมโครลิตร โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์1 | 1：1 | 0.769 | 81% |
| TS+0.5pg/ไมโครลิตร โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์1 | 1：20 | 0.777 | 82% |
| TS+0.5pg/ไมโครลิตร โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์1 | 1：250 | 0.803 | 82% |
ตารางที่ 6 อัตราการฟื้นตัวของสไปค์ การวิเคราะห์
-
ความแม่นยำ
- ความแม่นยำภายในการทดสอบ
การทดลองดำเนินการในระดับความเข้มข้นสามระดับ (สูง ปานกลาง และต่ำ) สำหรับตัวอย่างมาตรฐาน dsRNA ทั้งสี่ตัวอย่าง ในการทดลองครั้งเดียว ตัวอย่างความเข้มข้นแต่ละตัวอย่างจะต้องผ่านการทดสอบซ้ำแปดครั้ง ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าค่าสัมประสิทธิ์ความแปรปรวน (CV) ต่ำกว่า 15% บ่งชี้ถึงความแม่นยำภายในการทดสอบที่ดี
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์1 | |||
| เชิงทฤษฎี ความสัมพันธ์ (พีจี/ไมโครลิตร) | จำลอง | ค่าเฉลี่ยที่วัดได้ (pg/μL) | ซีวี |
| 1 | 8 | 1.0002 | 3.11% |
| 0.125 | 8 | 0.1230 | 0.46% |
| 0.0156 | 8 | 0.0164 | 3.18% |
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์ชนิดที่ 2 | |||
| เชิงทฤษฎี ความสัมพันธ์ (พีจี/ไมโครลิตร) | จำลอง | ค่าเฉลี่ยที่วัดได้ (pg/μL) | ซีวี |
| 1 | 8 | 1.0001 | 0.65% |
| 0.125 | 8 | 0.1231 | 2.46% |
| 0.0156 | 8 | 0.0162 | 0.02% |
| STD3 | |||
| เชิงทฤษฎี ความสัมพันธ์ (พีจี/ไมโครลิตร) | จำลอง | ค่าเฉลี่ยที่วัดได้ (pg/μL) | ซีวี |
| 2 | 8 | 2.0022 | 1.58% |
| 0.25 | 8 | 0.2444 | 2.17% |
| 0.0312 | 8 | 0.0328 | 1.64% |
| STD4 | |||
| เชิงทฤษฎี ความสัมพันธ์ (พีจี/ไมโครลิตร) | จำลอง | ค่าเฉลี่ยที่วัดได้ (pg/μL) | ซีวี |
| 8 | 8 | 8.0803 | 0.27% |
| 1 | 8 | 0.9650 | 0.12% |
| 0.125 | 8 | 0.1322 | 2.76% |
ตารางที่ 7 การวิเคราะห์ความแม่นยำภายในการทดสอบ
- ความแม่นยำระหว่างการทดสอบ
ได้ทำการทดลอง 3 ครั้งโดยใช้ชุดอุปกรณ์จาก 3 ชุดการทดลอง ในแต่ละการทดลอง จะเลือกความเข้มข้นสูง ปานกลาง และต่ำ และทดสอบสามครั้งสำหรับตัวอย่างมาตรฐาน dsRNA สี่ตัวอย่าง โดยมีการจำลองแปดครั้ง ดังนั้นจึงได้จุดข้อมูล 24 จุดในแต่ละชุด ระดับความเข้มข้นซึ่งนำไปใช้ในการวิเคราะห์ค่าสัมประสิทธิ์การแปรปรวน (CV) ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า CV สำหรับความเข้มข้นของมาตรฐานแต่ละชนิดอยู่ต่ำกว่า 15%
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์1 | |||
| เชิงทฤษฎี ความสัมพันธ์ (พีจี/ไมโครลิตร) | การทดสอบ/การจำลองแบบอิสระ | ค่าเฉลี่ยที่วัดได้ (pg/μL) | ซีวี |
| 1 | 3/8 | 1.0007 | 2.38% |
| 0.125 | 3/8 | 0.1186 | 3.20% |
| 0.0156 | 3/8 | 0.0173 | 1.27% |
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์ชนิดที่ 2 | |||
| เชิงทฤษฎี ความสัมพันธ์ (พีจี/ไมโครลิตร) | การทดสอบ/การจำลองแบบอิสระ | ค่าเฉลี่ยที่วัดได้ (pg/μL) | ซีวี |
| 1 | 3/8 | 0.9987 | 0.09% |
| 0.125 | 3/8 | 0.1269 | 1.06% |
| 0.0156 | 3/8 | 0.0151 | 0.52% |
| STD3 | |||
| เชิงทฤษฎี ความสัมพันธ์ (พีจี/ไมโครลิตร) | การทดสอบ/การจำลองแบบอิสระ | ค่าเฉลี่ยที่วัดได้ (pg/μL) | ซีวี |
| 2 | 3/8 | 2.0012 | 2.37% |
| 0.25 | 3/8 | 0.2415 | 0.14% |
| 0.0312 | 3/8 | 0.0330 | 1.81% |
| STD4 | |||
| เชิงทฤษฎี ความสัมพันธ์ (พีจี/ไมโครลิตร) | การทดสอบ/การจำลองแบบอิสระ | ค่าเฉลี่ยที่วัดได้ (pg/μL) | ซีวี |
| 8 | 3/8 | 7.9735 | 1.89% |
| 1 | 3/8 | 1.0225 | 0.13% |
| 0.125 | 3/8 | 0.1227 | 5.63% |
ตารางที่ 8 การวิเคราะห์ความแม่นยำระหว่างการทดสอบ
-
ความไวต่อความรู้สึก
- ลอด
ขีดจำกัดการตรวจจับของ ชุด ถูกกำหนดโดยการเพิ่มค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสองเท่าเข้ากับค่าเฉลี่ยของค่าว่าง โดยการวัด OD ของค่าว่าง 24 ค่า คำนวณค่าเฉลี่ยและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน จากนั้นนำค่าเหล่านี้ไปใช้กับเส้นโค้งที่ปรับให้พอดี จะได้ขีดจำกัดการตรวจจับที่สอดคล้องกัน ได้มาแล้ว
|
| โอดี |
| ||
| ดีเอสอาร์เอ็นเอ มาตรฐาน | ค่าเฉลี่ยของค่าว่าง | เอสดี ของว่างเปล่า | ค่าเฉลี่ยของค่าว่าง+2SD | ลอด |
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์1 | 0.016 | 0.00048 | 0.01696 | ≤0.001พิกกรัม/ไมโครลิตร |
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์ชนิดที่ 2 | 0.016 | 0.00072 | 0.01744 | ≤0.001พิกกรัม/ไมโครลิตร |
| STD3 | 0.034 | 0.00119 | 0.03638 | ≤0.001พิกกรัม/ไมโครลิตร |
| STD4 | 0.115 | 0.00290 | 0.1208 | ≤0.01พิกกรัม/ไมโครลิตร |
ตารางที่ 9 การวิเคราะห์ LOD
- ลอค
ขีดจำกัดเชิงปริมาณของ ชุด ได้จากการเจือจางจุดความเข้มข้นที่ต่ำที่สุดของเส้นโค้งมาตรฐานไปยังระดับที่ต่ำลงอีก โดยให้แน่ใจว่า CV น้อยกว่า 20% ที่ความเข้มข้นที่ต่ำที่สุด จึงกำหนดเกณฑ์เชิงปริมาณได้ LOQ เป็นดังต่อไปนี้
| ดีเอสอาร์เอ็นเอ มาตรฐาน | ลอค | จำลอง | ซีวี(%) | การกู้คืน - |
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์1 | 0.0156 พิกกรัมต่อไมโครลิตร | 24 | ＜10% | 80~120% |
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์ชนิดที่ 2 | 0.0312 พิกกรัมต่อไมโครลิตร | 24 | ＜10% | 80~120% |
| STD3 | 0.0156 พิกกรัมต่อไมโครลิตร | 24 | ＜10% | 80~120% |
| STD4 | 0.125 พิกกรัมต่อไมโครลิตร | 24 | ＜10% | 80~120% |
-
ดีความคงทน
- ป้องกันการรบกวนบนวัสดุ IVT
การทดสอบนี้ มุ่งหวังที่จะประเมินผลกระทบของเอนไซม์ บัฟเฟอร์ ฯลฯ ต่างๆ ที่เพิ่มเข้าไป เอ็มอาร์เอ็นเอ ตัวอย่างการตรวจหา dsRNA ด้วยชุดทดสอบ
การเติมความเข้มข้นที่เฉพาะเจาะจงของ T7 RNA polymerase, RNAse Inhibitor, IPPA (inorganic pyrophosphatase), DNase I, VCE (vaccinia capping enzyme), 2'-O-Methyltransferase (MT), 1×IVT buffer และ 1mM sodium citrate ลงในตัวอย่าง mRNA ที่ให้มา และจากนั้นจึงใช้ STD3 สำหรับการเตรียมเส้นโค้งมาตรฐานและการทดสอบตัวอย่าง ช่วยให้สามารถประเมินความสามารถของชุดทดสอบในการตรวจจับเนื้อหา dsRNA ในสิ่งเหล่านี้ได้ ตัวอย่าง ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าการมีเอนไซม์และบัฟเฟอร์ที่แตกต่างกันแปดชนิดไม่ส่งผลต่อความแม่นยำในการตรวจจับ dsRNA นอกจากนี้ อัตราการกู้คืนที่สังเกตได้ยังอยู่ในช่วง 80% ถึง 120%
| วัสดุ IVT | ดีเอสอาร์เอ็นเอ วัดได้ (pg/μL) | การกู้คืน |
| ไม่มี | 0.6057 | 100% |
| โพลิเมอร์อาร์เอ็นเอ T7 (15μg/mL) | 0.5411 | 89.32% |
| สารยับยั้ง RNase ของหนู (27.5μg/mL) | 0.5142 | 84.88% |
| ไพโรฟอสฟาเตสอนินทรีย์ (IPPA 10μg/mL) | 0.7132 | 117.7% |
| ดีเอ็นเอส ไอ (13.75 ไมโครกรัม/มล.) | 0.6077 | 100.32% |
| เอนไซม์ปิดฝาวัคซีน (10μg/mL) | 0.6563 | 108.3% |
| 2´-O-เมทิลทรานสเฟอเรส (10μg/mL) | 0.5776 | 95.4% |
| บัฟเฟอร์ IVT 1× | 0.5003 | 82.6% |
| 1มิลลิโมลาร์ โซเดียมซิเตรท | 0.6251 | 103.2% |
ตารางที่ 11 การกู้คืน STD3 เจือจางที่เติมด้วยวัสดุ IVT
- อุณหภูมิดความคงทน
ชุดอุปกรณ์ดังกล่าวถูกเก็บไว้ที่ทั้งสอง 4°C และ 37°C เพื่อตรวจหาความแปรปรวนของความเข้มข้นของมาตรฐาน dsRNA หลังจาก 7 วัน ผลการทดลองพบว่าความแปรปรวนทั้งหมดอยู่ภายใน 20%
| ดีเอสอาร์เอ็นเอ มาตรฐาน | ดีเอสอาร์เอ็นเอ วัดได้ (pg/μL) วันที่ 0 | ความแปรปรวน หลังจาก 7 วันที่อุณหภูมิ 4°C |
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์1 | 1 | 10% |
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์ชนิดที่ 2 | 1 | 5% |
| STD3 | 2 | 7% |
| STD4 | 4 | 11% |
| ดีเอสอาร์เอ็นเอ มาตรฐาน | ดีเอสอาร์เอ็นเอ วัดได้ (pg/μL) | ความแปรปรวน หลังจาก 7 วันที่อุณหภูมิ 37°C |
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์1 | 1 | 18% |
| โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์ชนิดที่ 2 | 1 | 4% |
| STD3 | 2 | 5% |
| STD4 | 4 | 8% |
ตารางที่ 12 การวิเคราะห์ความทนทานต่ออุณหภูมิ
สินค้าที่เกี่ยวข้อง:
| ชื่อสินค้า | รหัสสินค้า | ข้อมูลจำเพาะ |
| ชุดทดสอบ ELISA RNA สายคู่ (dsRNA) | 36717ES | 48T/96T |
| CleaScrip™ T7 RNA Polymerase (RNA ds ต่ำ 250 U/μL) | 10628ES | 10/100 ก.ว. |
| โพลิเมอร์อาร์เอ็นเอ T7 เกรด GMP（250 U/μL) | 10625ES | 10/100 ก.ว. |
อ่านเพิ่มเติม:
ใช้ชุด ELISA RNA สายคู่ (dsRNA) เพื่อตรวจสอบยืนยันการกลายพันธุ์ของ RNA โพลิเมอเรส T7 ที่มี dsRNA ต่ำ ร่วมกับวิธีการบล็อตจุดแอนติบอดี J2
การกลายพันธุ์ของ RNA โพลิเมอเรส T7 RNA dsRNA ต่ำ ส่งเสริมการพัฒนาวัคซีนและการบำบัดด้วย mRNA
อ้างอิง:
- ICH, 2022: การตรวจสอบวิธีการวิเคราะห์ ไตรมาสที่ 2 ฉบับร่าง
- NMPA, 2007: หลักการทั่วไปสำหรับการประเมินการตรวจสอบวิธีการวิเคราะห์สำหรับการวิเคราะห์การควบคุมคุณภาพผลิตภัณฑ์ทางชีววิทยา
- คณะกรรมการเภสัชตำราจีน (ChPC) 2020: เภสัชตำราจีน ส่วนที่ 4: แนวทางการตรวจสอบวิธีการวิเคราะห์เชิงปริมาณสำหรับตัวอย่างทางชีววิทยา