การพัฒนา T7 RNA polymerase (ต่ำ dsRNA) ที่มีการถ่ายโอนเทอร์มินัลต่ำและกิจกรรม RDRP ผ่าน FADS และการออกแบบกึ่งเหตุผล

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ยาที่ใช้ mRNA ได้รับความสนใจอย่างมากและดึงดูดความสนใจจากการวิจัย T7 RNAP เป็นที่รู้จักจากความเรียบง่ายและความสามารถในการเร่งปฏิกิริยาการสังเคราะห์ RNA ด้วยผลผลิตสูงและ ความแม่นยำในหลอดทดลอง อย่างไรก็ตาม ในระหว่างกระบวนการถอดรหัส T7 RNAP สามารถผลิตผลพลอยได้ เช่น RNA สั้นที่ล้มเหลว RNA ที่ยุติการทำงานก่อนกำหนด และ RNA ที่ขยาย 3' ซึ่งสร้างเงื่อนไขที่เอื้ออำนวยต่อการก่อตัวของ dsRNA ดังนั้น การลดการผลิต dsRNA จึงกลายเป็นความต้องการเร่งด่วนในการใช้งานจริง

เมื่อเร็วๆ นี้ มีงานวิจัยชิ้นสำคัญที่มีชื่อว่า "FADS และโพลีเมอเรส T7 RNA ที่ถูกดัดแปลงด้วยการออกแบบแบบกึ่งเหตุผลทำให้การผลิต dsRNA ลดลง โดยมีกิจกรรมของทรานสเฟอเรสเทอร์มินัลและ RDRP ที่ต่ำกว่า" ได้รับการเผยแพร่ออนไลน์โดย Yeasen และทีม Molefuture นักวิจัยประสบความสำเร็จในการออกแบบ T7 RNAP เพื่อลดการผลิตผลพลอยได้ของ dsRNA ในระหว่างการถอดรหัสอย่างมีนัยสำคัญ โดยลดลงเหลือ 1.8% ของเอนไซม์ประเภทป่าผ่านการผสมผสานระหว่างวิวัฒนาการแบบกำหนดทิศทางและการออกแบบแบบกึ่งมีเหตุผล

การคัดกรอง T7 RNAP โดยใช้ FADS

ในการคัดกรอง T7 RNAP นักวิจัยเลือกใช้ FADS (Fluorescence-activated droplet sorting) เพื่อตอบสนองความต้องการปริมาณงานสูงในการวิวัฒนาการของโปรตีน เพื่อป้องกันการแตกตัวของเซลล์ก่อนเวลาอันควร นักวิจัยใช้ชิป PDMS ที่มีเฟสน้ำสองเฟส โดยผสมไลโซไซม์กับเซลล์บนชิปและออกฤทธิ์ภายในหยด รูปที่ 1นักวิจัยได้สร้างไลบรารีกลายพันธุ์แบบสุ่มหลายแห่งที่มีความหลากหลายตั้งแต่ 10⁵ ถึง10⁶ภายหลังการคัดกรองแล้ว พบตัวแปรเด่น 10 ตัว และกำหนดให้เป็น Mut1 ถึง Mut10  ตามที่แสดงใน รูปที่ 2E และ รูปที่ 2Fปริมาณ dsRNA ของ Mut1, Mut7 และ Mut9 ต่ำกว่าของ wild-type อย่างมีนัยสำคัญ

รูปที่ 1 ภาพรวมของ FADS

รูปที่ 2 การคัดกรองห้องสมุดแบบสุ่มและการประเมินตัวแปร

การออกแบบกึ่งเหตุผลของ T7 RNAP

นักวิจัย ดำเนินการสำรวจการออกแบบแบบกึ่งมีเหตุผล สร้างห้องสมุดอิ่มตัวแบบไซต์เดียวสิบแห่ง และใช้โพรบคู่แบบไมโครไทเตอร์แบบดั้งเดิมสำหรับการคัดกรองรูปที่ 3) ใช้หัววัดปลาย 5' ที่เพิ่มเข้ามาเพื่อตรวจจับผลผลิต RNA

รูปที่ 3 การออกแบบกึ่งเหตุผลที่มีโครงสร้างนำทางสำหรับ dsRNA ที่ลดลง

หลังจากคัดกรองสารกลายพันธุ์มากกว่า 1,000 ชนิด นักวิจัย ระบุผู้สมัคร 6 ราย ได้แก่ Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H) และ Mut16 (I743L) ผลผลิต RNA ทั้งหมดของมิวแทนต์ทั้ง 6 นี้ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญจากแบบไวด์ไทป์ ซึ่งบ่งชี้ถึงประสิทธิภาพการถอดรหัสโดยรวมที่เปรียบเทียบได้ คาดว่าปริมาณ dsRNA ของ Mut11 และ Mut14 จะต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับแบบไวด์ไทป์รูปที่ 4-

รูปที่ 4 การคัดกรองแผ่นไมโครไทเตอร์และการประเมินตัวแปร

Mut17 จากการสับเปลี่ยน DNA ให้ dsRNA น้อยลง

เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพ T7 RNAP เพิ่มเติม จึงเลือกตัวแปรสี่ตัวที่มีปริมาณ dsRNA ต่ำในขณะที่ตรงตามข้อกำหนดการผลิตจากนั้นนักวิจัยจึงสร้างคลังข้อมูลการสับเปลี่ยน DNA และคัดกรองด้วยไมโครไทเตอร์เพลต ระบุตัวแปรที่แสดงการผลิต dsRNA ต่ำกว่าเมื่อเทียบกับ T7 RNAP ของบรรพบุรุษ ซึ่งมีชื่อว่า Mut17 (A70Q/F162S/K180E) จากนั้นพวกเขาจึงวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์การถอดรหัสของ Mut17 และตัวแปรของบรรพบุรุษ (Mut14, Mut11 และ Mut7) ดังที่แสดงใน รูปที่ 5ทั้งสี่สายพันธุ์แสดงให้เห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในการผลิต dsRNA ในระหว่างการถอดรหัสเมื่อเทียบกับสายพันธุ์ป่า ที่น่าทึ่งคือ Mut17 แสดงให้เห็นปริมาณ dsRNA ที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเพียง 1.80% และต่ำถึง 0.007 ng/μg ในระบบตัวทำละลายของการคัดกรอง

รูปที่ 5 ปริมาณ dsRNA ของ Mut17 และการกลายพันธุ์ของพ่อแม่

ภูมิคุ้มกันของผลิตภัณฑ์ IVT จากกลายพันธุ์นั้นต่ำกว่าของชนิดป่าอย่างมีนัยสำคัญ

ต่อไป, เราประเมินภูมิคุ้มกันของผลิตภัณฑ์ IVT ใน RA ของหนูW264เซลล์ 7 เซลล์ ดังที่แสดงในรูปที่ 2A และ 2B ระดับ IFN-β mRNA และโปรตีนลดลงใน RAW264เซลล์ .7 ที่ถูกถ่ายโอนยีนด้วย mRNA ที่ผลิตโดยกลายพันธุ์เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ชนิดป่า ซึ่งบ่งชี้ว่า mRNA ที่สังเคราะห์โดย RNAP T7 ชนิดป่ากระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่งที่สุด ในขณะที่ mRNA จากกลายพันธุ์แสดงให้เห็นการตอบสนองที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง mRNA IFN-β ของเซลล์ที่ได้รับการบำบัดด้วย Mut11 RNA มีเพียง 9.7% ของเซลล์ที่ได้รับการบำบัดด้วย wild type และโปรตีนอยู่ที่ 12.93 pg/mL นอกจากนี้ การแสดงออกของ EGFP ไม่แสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณหรือคุณภาพระหว่าง mRNA ที่สร้างโดย T7 RNAP ที่แตกต่างกัน (รูปที่ 6C), ตอบสนองความต้องการการใช้งานด้านอุตสาหกรรม

รูปที่ 6 การตอบสนองของ IFN-β และการแสดงออกของ EGFP ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม

กิจกรรม RDRP และเทอร์มินัลทรานสเฟอเรสของมิวแทนต์นั้นมีน้อยมากเราr มากกว่าพวกประเภทป่า

เพื่อตรวจสอบผลกระทบของการกลายพันธุ์ต่อการลด dsRNA นักวิจัย ดำเนินการศึกษาในซิลิโกกับการกลายพันธุ์ทั้งหมดเหล่านี้ ผลลัพธ์ชี้ให้เห็นอย่างชัดเจนว่ากิจกรรม RDRP ในตัวแปรลดลง เนื่องจากมีแนวโน้มลดลงในการใช้ RNA เป็นแม่แบบ ในทำนองเดียวกัน สิ่งนี้อาจส่งผลกระทบต่อกิจกรรมเทอร์มินัลทรานสเฟอเรสของ RNAP T7 ตามที่แสดงใน รูป 7ภายใต้ความเข้มข้นที่แตกต่างกัน รูปแบบทั้ง 4 แบบแสดงค่าการเรืองแสงน้อยกว่า 50% เมื่อเปรียบเทียบกับแบบป่า

จากนั้นจึงใช้การทดสอบความไม่เป็นเนื้อเดียวกันที่ปลาย 3' เพื่อระบุลักษณะกิจกรรมการถ่ายโอนปลายสุดของ RNAP T7 เมื่อเน้นที่สัดส่วนของ RNA ที่มี n>0 ซึ่งสะท้อนถึงกิจกรรมการถ่ายโอนปลายสุด นักวิจัย พบว่า RNA เหล่านี้คิดเป็น 82.94% ใน wild-type ในขณะที่มิวแทนต์แสดงเปอร์เซ็นต์ดังต่อไปนี้: Mut11 (70.29%), Mut7 (67.88%), Mut14 (63.31%) และ Mut17 (55.62%) (รูป 8-สิ่งสำคัญคือ เปอร์เซ็นต์เหล่านี้มีความสอดคล้องอย่างมากกับความอุดมสมบูรณ์ของ dsRNA ในผลิตภัณฑ์ (รูปที่ 5)ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ถึงการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมของเทอร์มินัลทรานสเฟอเรสของมิวแทนต์ ซึ่งเมื่อรวมกับการลดลงของกิจกรรมของ RDRP แล้ว จะส่งผลต่อการลดลงของ dsRNAโดยเฉพาะอย่างยิ่ง กิจกรรมของเทอร์มินัลทรานสเฟอเรสอาจมีบทบาทที่สำคัญยิ่งขึ้น ดังจะเห็นได้จากการสะสม n>0 RNA ที่ต่ำที่สุดที่สังเกตได้ใน Mut17 ซึ่งยังแสดงให้เห็นการผลิต dsRNA ที่ต่ำที่สุดอีกด้วย (รูปที่ 5 และรูปที่ 8--

รูป 7. กิจกรรม RDRP ที่สัมพันธ์กัน

รูป 8. ความไม่เป็นเนื้อเดียวกันในปลาย 3' ของผลิตภัณฑ์ RNA

บทสรุป

การศึกษานี้นำเสนอวิธีการที่แข็งแกร่งสำหรับการระบุกลายพันธุ์ที่มีปริมาณ dsRNA ลดลง และสามารถแยกกลายพันธุ์ dsRNA ได้หลายตัวที่มีกิจกรรม RNA-dependent RNA polymerase และ terminal transferase ลดลงได้สำเร็จ โดยช่วยสนับสนุนการรับรองความปลอดภัยและประสิทธิผลที่สำคัญของการบำบัดด้วย mRNA อย่างมาก ซึ่งเน้นย้ำถึงนัยสำคัญในการพัฒนาวัคซีน mRNA และการประยุกต์ใช้ยีนบำบัด

ในเวลาเดียวกันบริษัทแม่ Yeasen ได้เปิดตัวผลิตภัณฑ์ T7 RNAP ที่ช่วยลด dsRNA ได้อย่างมีนัยสำคัญ เนื้อหา พันธมิตรหลายรายได้ทดสอบโปรตีนกลายพันธุ์ T7 RNAP ดัดแปลงที่พัฒนาโดย Molefuture แล้ว และผลิตภัณฑ์ได้รับการยอมรับจากลูกค้าเป็นอย่างมาก ลูกค้าของเราเชื่อว่าการใช้เอนไซม์ตัวใหม่ช่วยลดความยุ่งยากของกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ของ mRNA และช่วยลดภูมิคุ้มกันของ IVT ได้อย่างมาก ผลิตภัณฑ์แสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพที่โดดเด่นในสถานการณ์การใช้งานที่หลากหลาย พิสูจน์ให้เห็นถึงศักยภาพในการประยุกต์ใช้ที่กว้างขวางในสาขาเภสัชชีวภาพ!

ข้อมูลการสั่งซื้อ

ต่อไปนี้เป็นผลิตภัณฑ์ตัวแทนที่นำเสนอโดย Yeasenมีขนาดเพิ่มเติมให้เลือก ผลิตภัณฑ์ของเราได้รับการปรับให้เหมาะสมอย่างยิ่งเพื่อทำงานร่วมกัน เพื่อช่วยให้มั่นใจถึงประสิทธิภาพและความสามารถในการทำซ้ำที่เหนือกว่า เรายังสามารถให้บริการที่กำหนดเองได้ หากคุณสนใจผลิตภัณฑ์ที่ไม่ได้แสดงไว้ โปรดติดต่อเรา และเราจะทำงานร่วมกับคุณเพื่อตอบสนองความต้องการของคุณ