คู่มือที่ครอบคลุมเกี่ยวกับการเพาะปลูกออร์แกนิด

— บทความที่ครอบคลุมเพื่อทำความเข้าใจเรื่องออร์แกนอยด์ให้ลึกซึ้งยิ่งขึ้น

บทนำเกี่ยวกับออร์แกนอยด์

ออร์แกนอยด์เป็นโครงสร้างสามมิติที่มีหน้าที่ทางสรีรวิทยาที่เลียนแบบสภาพปกติ (หรือป่วย) ของอวัยวะหรือเนื้อเยื่อภายใน ซึ่งทำได้โดยการเพาะเลี้ยงแบบสามมิติภายนอกร่างกาย พูดง่ายๆ ก็คือ ออร์แกนอยด์เป็นเซลล์เพาะเลี้ยงสามมิติที่เซลล์ต้นกำเนิดได้รับการเพาะเลี้ยงในเจลเมทริกซ์ ภายใต้อิทธิพลของสารเคมียับยั้ง/ตัวกระตุ้น ไซโตไคน์ และสารเติมแต่งในการเพาะเลี้ยง ออร์แกนอยด์จะพัฒนาเป็นโครงสร้างเนื้อเยื่อที่คล้ายกับอวัยวะที่เกี่ยวข้อง

ลักษณะของออร์แกไนด์

ออร์แกนอยด์มีความสามารถในการต่ออายุตัวเอง โดยรักษาโครงสร้างทางสรีรวิทยาและหน้าที่ของเนื้อเยื่อต้นกำเนิดไว้ ออร์แกนอยด์มักถูกเรียกว่า "อวัยวะขนาดเล็กในจานเพาะเลี้ยง" โดยอาศัยความสามารถในการต่ออายุตัวเอง การแยกตัว และการจัดระเบียบตัวเองของเซลล์ต้นกำเนิด ออร์แกนอยด์สามารถแช่แข็งเพื่อใช้ในธนาคารชีวภาพและสามารถขยายตัวได้ไม่จำกัด ออร์แกนอยด์มีความซับซ้อนมาก และเมื่อเทียบกับเซลล์ 2 มิติแล้ว จะมีลักษณะใกล้เคียงกับสถานะในร่างกายมากกว่า

รูปที่ 1 การเพาะเลี้ยงเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ของมนุษย์ด้วยออร์แกนอยด์ [1]

การประยุกต์ใช้ของออร์แกไนด์

คุณลักษณะเฉพาะของออร์แกนอยด์คือความสามารถในการจำลองสภาพแวดล้อมในร่างกายได้ดีขึ้น ทำให้เหมาะสำหรับการวิเคราะห์ทางชีววิทยาโมเลกุลและเซลล์ ออร์แกนอยด์เป็นสะพานเชื่อมระหว่างระดับสัตว์และเซลล์ จึงเป็นโซลูชันที่เหนือกว่าสำหรับการวิจัยในด้านต่างๆ เช่น การศึกษาเนื้องอก การคัดกรองยา การแพทย์ฟื้นฟู และอื่นๆ อีกมากมาย ออร์แกนอยด์ได้รับการนำไปใช้กันอย่างแพร่หลายในการกระตุ้นเนื้อเยื่อที่มีการทำงาน การสร้างแบบจำลองโรค การคัดกรองยา การทดสอบต้านการอักเสบ การวิจัยทางคลินิก และด้านการวิจัยอื่นๆ อีกมากมาย ซึ่งแสดงให้เห็นถึงศักยภาพที่ยอดเยี่ยมทั้งในการวิจัยพื้นฐานและการประยุกต์ใช้ในการแปลผล

เนื่องจากระบบการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์และเทคนิคการทดลองยังคงพัฒนาอย่างต่อเนื่อง ออร์แกนอยด์จึงถูกนำมาใช้กับเนื้อเยื่อและอวัยวะต่างๆ มากมาย รวมถึงลำไส้ (ลำไส้เล็ก/ลำไส้ใหญ่) กระเพาะอาหาร ตับ หัวใจ ปอด ต่อมลูกหมาก ตับอ่อน ไต เต้านม โครงสร้างคล้ายสมอง จอประสาทตา หูชั้นใน และอื่นๆ อีกมากมาย

ออร์แกนอยด์ที่ได้จากเซลล์ต้นกำเนิดของเนื้องอกแสดงให้เห็นถึงศักยภาพที่สำคัญในการทำความเข้าใจกลไกการเกิดและการพัฒนาของเนื้องอก การคัดกรองความไวต่อยา และการส่งเสริมการแพทย์เฉพาะบุคคลและการวินิจฉัยเฉพาะบุคคล บทความหลายฉบับจาก Cell and Science ระบุว่าออร์แกนอยด์มีความไวและความจำเพาะสูงในการทำนายประสิทธิภาพของยาต้านมะเร็ง เมื่อไม่นานนี้ ออร์แกนอยด์ของเนื้องอกได้แสดงให้เห็นถึงบทบาทในการทำนายการตอบสนองของผู้ป่วยต่อยาต้านมะเร็งและช่วยในการกำหนดแผนการรักษาเฉพาะบุคคล

การวิจัยกลไกการพัฒนา: ความสามารถในการแยกตัวของออร์แกนอยด์ทำให้เหมาะสำหรับการศึกษาขั้นตอนและกลไกการพัฒนาของตัวอ่อน กระบวนการเหนี่ยวนำที่ควบคุมโดยเส้นทางการส่งสัญญาณ เช่น Wnt และ BMP สามารถใช้ในการศึกษาการพัฒนาของอวัยวะ เช่น สมอง ตับอ่อน และกระเพาะอาหาร [2][3][4]

การสร้างแบบจำลองการบาดเจ็บจากโรค: ออร์แกนอยด์ที่เหนี่ยวนำจากเนื้อเยื่อหรืออวัยวะเฉพาะสามารถใช้ในการศึกษารูปแบบของโรคเฉพาะได้ ทีมวิจัยที่นำโดย Zhao Bing และ Lin Xinhua ใช้แบบจำลองการติดเชื้อออร์แกนอยด์ในมนุษย์เพื่อศึกษาเกี่ยวกับกลไกโมเลกุลของการติดเชื้อ SARS-CoV-2 และความเสียหายของตับ ซึ่งเป็นเครื่องมือสำคัญสำหรับการวิจัยกลไกการก่อโรคของไวรัสและการพัฒนายาที่ตามมา [5] กลุ่มวิจัยที่นำโดย Deng Hongkui จากคณะวิทยาศาสตร์ชีวภาพของมหาวิทยาลัยปักกิ่งใช้โมเลกุลขนาดเล็กและไซโตไคน์เพื่อกระตุ้นการสร้างออร์แกนอยด์ลำไส้ชนิดใหม่ที่มีคุณสมบัติในการสร้างความเสียหายใหม่ นั่นก็คือ Hyper Organoidออร์แกนอยด์นี้สามารถผ่านและเพิ่มปริมาณได้ในระยะเวลาที่ขยายออก โดยรักษาจีโนมและส่งเสริมการซ่อมแซมเนื้อเยื่อลำไส้ใหญ่ที่ได้รับความเสียหาย บรรเทาอาการทางพยาธิวิทยาในสัตว์ทดลองที่เป็นโรคลำไส้ใหญ่อักเสบเฉียบพลัน และอื่นๆ อีกมากมาย [6]

การแพทย์ฟื้นฟู: ออร์แกนอยด์ที่ได้จากเซลล์ต้นกำเนิดสามารถซ่อมแซมหรือแทนที่เนื้อเยื่อที่เสียหายหรือเป็นโรคเพื่อฟื้นฟูการทำงานของเนื้อเยื่อให้เป็นปกติ ออร์แกนอยด์เหล่านี้มีการนำไปใช้ในการบำบัดด้วยเซลล์อย่างกว้างขวาง รวมถึงโรคระบบประสาทเสื่อมอื่นๆ โรคเบาหวาน โรคหัวใจและหลอดเลือด โรคจอประสาทตา การบาดเจ็บที่ไขสันหลัง และอื่นๆ อีกมากมาย DA01 ซึ่งใช้โมเลกุลขนาดเล็ก เช่น SB-431542, LDN193189, CHIR-99021, Y-27632 และโปรตีน Sonic Hedgehog (Shh) เป็นการรักษาแบบใหม่ในสาขาการแพทย์ฟื้นฟู โดยกระตุ้นเซลล์ต้นกำเนิดที่มีศักยภาพในการแบ่งตัวเป็นเซลล์ประสาทโดพามีน จากนั้นเซลล์ประสาทเหล่านี้จะถูกปลูกถ่ายเข้าไปในบริเวณสมองที่ได้รับบาดเจ็บของผู้ป่วยโรคพาร์กินสันในระยะท้าย ซึ่งเป็นแนวทางและแนวทางใหม่ในการรักษาโรคนี้ [7]

การทดสอบความเป็นพิษและประสิทธิผลของยา: สามารถใช้ Organoids เพื่อยืนยันความเป็นพิษของยาใหม่ในอวัยวะหรือเนื้อเยื่อเฉพาะ ซึ่งให้ข้อมูลสนับสนุนการพัฒนายาใหม่ การใช้ Organoids ของไต Hyman เพื่อยืนยันความเป็นพิษของ Cisplatin ต่อไตเป็นตัวอย่าง [8]

การคัดกรองยา: ออร์แกนอยด์ที่ได้จากเซลล์ต้นกำเนิดสามารถใช้ในการทดสอบปฏิกิริยาของยาในหลอดทดลอง ซึ่งให้การสนับสนุนทางทฤษฎีสำหรับการคัดกรองยา ออร์แกนอยด์ของลำไส้ใหญ่สามารถใช้ในการศึกษาแผนการใช้ยาสำหรับผู้ป่วยที่มีการกลายพันธุ์ของ CFTR และออร์แกนอยด์ของเนื้องอกสามารถใช้ในการประเมินสถานการณ์การใช้ยาเฉพาะบุคคลสำหรับผู้ป่วย [9]

ประวัติการพัฒนาของออร์แกนอยด์

แหล่งที่มาของออร์แกนิคส์

ออร์แกนอยด์ปกติส่วนใหญ่มาจากเซลล์ต้นกำเนิด รวมถึงเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพ (PSC) และเซลล์ต้นกำเนิดของผู้ใหญ่ (ASC) เซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพ ได้แก่ เซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อน (ESC) และเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพที่เหนี่ยวนำ (iPSC) เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพแล้ว เซลล์ต้นกำเนิดของผู้ใหญ่มีข้อได้เปรียบตรงที่สามารถสร้างแบบจำลองได้ง่ายกว่าและเร็วกว่า แต่มีข้อเสียตรงที่สร้างโครงสร้างออร์แกนอยด์ได้ง่ายกว่าเมื่อเทียบกัน โครงสร้างออร์แกนอยด์ที่สร้างจากเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพมีความซับซ้อนมากกว่า

สินค้าที่ใช้ใน การเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์

โมเลกุลขนาดเล็กที่ใช้กันทั่วไปในวัฒนธรรมออร์แกนอยด์ (สรุป): ใช้งานได้จริงมาก อย่าลืมคั่นหน้าไว้!

❶ Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES): สารยับยั้ง Rock ที่มีประสิทธิภาพ ยับยั้ง p160ROCK (Ki=140 nM) และ ROCK-II (IC50=800 nM) อย่างมีการแข่งขันโดยการแข่งขัน ATPนอกจากนี้ยังยับยั้ง PRK2 (IC50=600 nM) โดยทั่วไปจะเติมลงไประหว่างการเพาะเลี้ยงครั้งแรกในจานเพาะเลี้ยง การเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อในภายหลังอาจไม่จำเป็นต้องเติมลงไป การบำบัดเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนมนุษย์ด้วย Y-27632 (10 µM) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงสามารถยับยั้งอะพอพโทซิส เพิ่มประสิทธิภาพของโคลน และขยายระยะเวลาการผ่านของเซลล์

ความเข้มข้นในการทำงานที่แนะนำ: 10 μM

❷ SB-202190 (Cat#53005ES): สารยับยั้ง p38 MAPK kinase ที่มีประสิทธิภาพ ซึ่งกำหนดเป้าหมายที่ p38α/β SB202190 สามารถกระตุ้นการแบ่งตัวของเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนของมนุษย์ไปเป็นเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ ส่งเสริมการต่ออายุของเซลล์ต้นกำเนิดของระบบประสาท และสามารถนำไปใช้กับการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ของระบบทางเดินอาหารและต่อมน้ำนมได้

ความเข้มข้นในการละลายที่แนะนำ: ละลาย 10 มก. ใน DMSO 3.018 มล. เพื่อให้ได้สารละลาย 10 มิลลิโมลาร์ เก็บที่อุณหภูมิ -20℃

ความเข้มข้นในการทำงานที่แนะนำ: 10 μM

❸ CHIR-99021 (Cat#53003ES): อนุพันธ์ของอะมิโนไพริมิดีนซึ่งทำหน้าที่เป็นสารยับยั้ง GSK-3 (GSK3α/β) อนุพันธ์นี้กระตุ้นให้เซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อนมนุษย์แบ่งตัวเป็นเอนโดเดิร์ม และใช้ในออร์แกนอยด์ของไตและจอประสาทตา เมื่อใช้ร่วมกับรีเอเจนต์อื่น CHIR-99021 จะกระตุ้นการรีโปรแกรมเซลล์โซมาติกเป็นเซลล์ต้นกำเนิด

ความเข้มข้นในการละลายที่แนะนำ: ละลาย 5 มก. ใน DMSO 3.58 มล. เพื่อให้ได้สารละลาย 3 มิลลิโมลาร์ เก็บที่อุณหภูมิ -20℃

ความเข้มข้นในการทำงานที่แนะนำ: 3 μM

❹ A 83-01 (Cat#53002ES): สารยับยั้งทางเดิน Activin/NODAL/TGF-β ที่ยับยั้งกิจกรรมของไคเนส ALK5/4/7 โดยทั่วไปใช้ในการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ของตับ ต่อมลูกหมาก และต่อมน้ำนม โดยทั่วไปมักใช้เพื่อยับยั้งการแบ่งตัวของเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพที่เหนี่ยวนำ (induced pluripotent stem cells หรือ iPSCs) และรักษาการต่ออายุตัวเองของเซลล์ในหลอดทดลอง

ความเข้มข้นในการละลายที่แนะนำ: ละลาย 5 มก. ใน DMSO 5.93 มล. เพื่อให้ได้สารละลาย 2 มิลลิโมลาร์ เก็บที่อุณหภูมิ -20℃ (หมายเหตุ: ผลิตภัณฑ์นี้ไม่เสถียรในสารละลายและแนะนำให้ใช้ทันทีหลังจากเตรียม)

ความเข้มข้นในการทำงานที่แนะนำ: 2 μM

❺ แกสตริน I (Cat#53007ES): แกสตรินเป็นฮอร์โมนเปปไทด์ภายในระบบทางเดินอาหารซึ่งกระตุ้นให้เซลล์ผนังกระเพาะอาหารหลั่งกรดในกระเพาะอาหาร เป็นสิ่งสำคัญในการศึกษาออร์แกนอยด์ในระบบทางเดินอาหาร เมื่อเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ในลำไส้และตับ การเติมแกสตรินจะช่วยยืดอายุการอยู่รอดของออร์แกนอยด์

ความเข้มข้นในการละลายที่แนะนำ: ละลาย 1 มก. ในสารละลายแอมโมเนีย 1% ปริมาณ 2.38 มล. เพื่อให้ได้สารละลาย 0.2 มิลลิโมลาร์ เก็บที่อุณหภูมิ -20℃

ความเข้มข้นในการทำงานที่แนะนำ: 10 nM

❻ นิโคตินาไมด์ (Cat#51402ES): นิโคตินาไมด์ ซึ่งเป็นวิตามินบี 3 มีส่วนร่วมในปฏิกิริยารีดอกซ์ของเอนไซม์ต่างๆ และใช้ในการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ในระบบทางเดินอาหาร ตับ และต่อมน้ำนม นิโคตินาไมด์เมื่อใช้ร่วมกับไซโตไคน์และรีเอเจนต์ทางชีวเคมีอื่นๆ จะแสดงคุณสมบัติต้านการอักเสบ ส่งเสริมการแบ่งตัวของเซลล์ต้นกำเนิดของเนื้อเยื่อเกี่ยวพันเป็นเซลล์ที่ผลิตอินซูลิน ยับยั้งกิจกรรมของเซอร์ทูอิน และใช้เพื่อส่งเสริมการสร้างออร์แกนอยด์และยืดอายุของออร์แกนอยด์

ความเข้มข้นในการละลายที่แนะนำ: ละลาย 100 มก. ใน H2O (หรือ DMSO) 8.19 มล. เพื่อให้ได้สารละลาย 100 มิลลิโมลาร์ เก็บที่อุณหภูมิ -20℃

ความเข้มข้นในการทำงานที่แนะนำ: 10 mM

❼ ฟอร์สโคลิน (หมายเลขสินค้า 51001ES): ฟอร์สโคลินสามารถกระตุ้นอะดีไนเลตไซเคลส ซึ่งมักใช้เพื่อเพิ่มระดับ cAMP ในเซลล์ ฟอร์สโคลินกระตุ้นการแบ่งตัวของเซลล์ประเภทต่างๆ กระตุ้น PXR และ FXR และมีฤทธิ์ต้านการรวมตัวของเกล็ดเลือดและลดความดันโลหิต เมื่อเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ของตับ จำเป็นต้องเติมสารนี้ลงไป

ความเข้มข้นในการทำงานที่แนะนำ: 1-10 μM

❽ โพรสตาแกลนดินอี2 (Cat#60810ES): โพรสตาแกลนดินอี2 (PGE2) ควบคุมระบบสรีรวิทยาหลายระบบ โดยทำหน้าที่ควบคุมการแพร่กระจายและการแบ่งตัวของเซลล์มีความจำเป็นเมื่อเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ของตับและต่อมลูกหมาก และเกี่ยวข้องกับการคลายตัวของกล้ามเนื้อเรียบ การอักเสบ การสืบพันธุ์ การควบคุมวงจรการนอนหลับ และความสมบูรณ์ของเยื่อบุกระเพาะอาหาร

ความเข้มข้นในการละลายที่แนะนำ: ละลาย 1 มก. ใน DMSO 0.28 มล. เพื่อให้ได้สารละลาย 10 มิลลิโมลาร์ เก็บที่อุณหภูมิ -20℃

ความเข้มข้นในการทำงานที่แนะนำ: 500 nM

❾ N-acetyl-L-Cysteine ​​(Cat#50303ES): N-acetyl-L-cysteine ​​(NAC) เป็นสารตั้งต้นของกลูตาไธโอนซึ่งเป็นสารต้านอนุมูลอิสระ โดยมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและยับยั้ง ROS ช่วยยับยั้งการตายของเซลล์ประสาทและจำเป็นต่อกระบวนการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ส่วนใหญ่

ความเข้มข้นในการละลายที่แนะนำ: ละลาย 2 กรัมใน H2O (หรือ DMSO) ปริมาณ 24.51 มิลลิลิตร เพื่อให้ได้สารละลาย 500 มิลลิโมลาร์ เก็บที่อุณหภูมิ -20℃

ความเข้มข้นในการทำงานที่แนะนำ: 1 mM

ข้อมูลสินค้าที่เกี่ยวข้อง

อ้างอิง：

[1] Sato T, Stange DE และคณะการขยายตัวในระยะยาวของออร์แกนอยด์ของเยื่อบุผิวจากลำไส้ใหญ่ของมนุษย์ เนื้องอกต่อม มะเร็งต่อมน้ำเหลือง และเยื่อบุผิวบาร์เร็ตต์ Gastroenterology. 2011 พ.ย.;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2 ก.ย. 2554 PMID: 21889923

[2] Lancaster MA, Renner M และคณะ ออร์แกนอยด์สมองเป็นแบบจำลองการพัฒนาสมองของมนุษย์และภาวะศีรษะเล็ก Nature. 2013.501(7467):373-379 http://dx.doi.org/10.1038/nature12517-

[3] Greggio C และคณะ ช่องสามมิติเทียมวิเคราะห์การพัฒนาตับอ่อนในหลอดทดลอง Development. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628-

[4] McCracken KW และคณะ การสร้างแบบจำลองพัฒนาการของมนุษย์และโรคในออร์แกนอยด์กระเพาะอาหารที่ได้จากเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพ Nature. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863-

[5] Zhao B, Ni C และคณะ การสรุปการติดเชื้อ SARS-CoV-2 และความเสียหายของเซลล์ท่อน้ำดีด้วยออร์แกนอยด์ท่อน้ำดีของตับมนุษย์ Protein Cell. 2020 ต.ค.;11(10):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704

[6] Qu M, Xiong L และคณะ การสร้างวัฒนธรรมออร์แกนอยด์ของลำไส้เพื่อสร้างแบบจำลองการสร้างเยื่อบุผิวใหม่ที่เกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บ Cell Res. 2021 มี.ค.;31(3):259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Epub 2021 ม.ค. 8. PMID: 33420425; PMCID: PMC8027647

[7] BlueRock Therapeutics ประกาศผู้ป่วยรายแรกที่ได้รับยา DA01 ในการศึกษาระยะที่ 1 ในผู้ป่วยโรคพาร์กินสันระยะลุกลาม ข่าวเผยแพร่ของ BlueRock Therapeutics: 8 มิถุนายน 2021

[8] Takasato M, Er PX และคณะ ออร์แกนอยด์ของไตจากเซลล์ iPS ของมนุษย์มีหลายสายพันธุ์และเป็นแบบจำลองของการสร้างไตในมนุษย์ Nature. 2015.526(7574):564-568 http://dx.doi.org/10.1038/nature15695-

[9] Spence JR, Mayhew CN และคณะ การแบ่งเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพของมนุษย์แบบกำหนดเป้าหมายเป็นเนื้อเยื่อลำไส้ในหลอดทดลอง ธรรมชาติ. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691-