Organoids ศึกษาคำถาม & คำตอบ: ทุกสิ่งที่คุณจำเป็นต้องรู้

จากการศึกษาวิจัยเกี่ยวกับออร์แกนอยด์ที่เจาะลึกมากขึ้น ทำให้มีผู้เข้าร่วมเพิ่มมากขึ้น บทความนี้สรุปประเด็นความรู้ทั่วไปเกี่ยวกับออร์แกนอยด์ [1-5] โดยหวังว่าบทความนี้จะเป็นประโยชน์ต่อทุกคน

ถาม: ออร์แกนอยด์ประกอบด้วยเซลล์ประเภทเดียวหรือเนื้อเยื่อหลายเซลล์?

ออร์แกนอยด์เกิดจากการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดของผู้ใหญ่หรือเซลล์ต้นกำเนิดที่มีศักยภาพในการแบ่งตัวเป็นหลายเซลล์ในหลอดทดลองแบบสามมิติ (3D) ส่งผลให้เกิดโครงสร้างคล้ายเนื้อเยื่อที่มีการจัดระเบียบในเชิงพื้นที่ ออร์แกนอยด์ไม่ใช่โครงสร้างที่ประกอบด้วยเซลล์เดี่ยว แต่เกิดจากการเหนี่ยวนำการแบ่งตัวและการแยกตัวของเซลล์เริ่มต้นที่มีคุณสมบัติของเซลล์ต้นกำเนิด จากนั้นเซลล์เหล่านี้จะรวมตัวกันเป็นเนื้อเยื่อที่มีโครงสร้างเชิงพื้นที่ สัณฐานวิทยา และการทำงานที่คล้ายกับอวัยวะที่เกี่ยวข้องในร่างกาย

ถาม: แหล่งเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์มีอะไรบ้าง?

(1) ออร์แกนอยด์ที่ได้จากเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพ ได้แก่ เซลล์ต้นกำเนิดของผู้ใหญ่ (ASC) เซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพ (PSC) และเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพที่เหนี่ยวนำ (iPSC) (2) ออร์แกนอยด์ที่ได้จากเซลล์ที่สกัดจากเนื้อเยื่อมักพบในเนื้อเยื่อเนื้องอก

ถาม: สามารถใช้เนื้อเยื่อแช่แข็งสำหรับการเพาะเลี้ยงแบบ 3 มิติได้หรือไม่ หากไม่มีเนื้อเยื่อสด?

ใช่ แต่มีข้อกำหนดที่สูงกว่าสำหรับขนาดของเนื้อเยื่อแช่แข็ง และความสามารถในการมีชีวิตรอดของเนื้อเยื่อและเซลล์แช่แข็งขั้นต้นจะลดลงอย่างมาก ส่งผลให้อัตราความสำเร็จในการเพาะเลี้ยงในภายหลังลดลงอย่างมาก

ถาม: ออร์แกนอยด์จะถูกแช่แข็งและฟื้นคืนชีพได้อย่างไร?

เวลาที่เหมาะสมที่สุดในการแช่แข็งออร์แกนอยด์คือช่วงที่ 2-5 ซึ่งเป็นช่วงที่ออร์แกนอยด์มีกิจกรรมและศักยภาพในการแบ่งตัวที่ดีที่สุด การฟื้นคืนชีพของออร์แกนอยด์สามารถทำได้ตามวิธีการที่ใช้ในการฟื้นคืนชีพของเซลล์

ถาม: จำเป็นต้องควบคุมขนาดของออร์แกนอยด์ที่เพาะเลี้ยงหรือไม่ และจะเป็นประโยชน์หรือไม่หากออร์แกนอยด์มีขนาดใหญ่เกินไป?

ใช่ จำเป็นต้องควบคุมขนาด โดยควรอยู่ภายใน 500μm เนื่องจากออร์แกนอยด์ไม่มีระบบไหลเวียนภายในหลอดเลือดและก๊าซ-ของเหลว เมื่อออร์แกนอยด์มีขนาดใหญ่ เซลล์ใกล้ศูนย์กลางจะแลกเปลี่ยนออกซิเจนและสารอาหารกับสภาพแวดล้อมภายนอกได้ยาก ดังนั้น ยิ่งโครงสร้างมีขนาดใหญ่ จำนวนเซลล์ที่ตายแล้วก็จะมากขึ้น

ถาม: นอกจากการใช้เจลเมทริกซ์แล้ว สามารถใช้สิ่งใดอีกในการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์?

นอกจากเจลเมทริกซ์แล้ว ทางเลือกสำหรับการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ยังได้แก่ (1) เมทริกซ์นอกเซลล์ที่ถูกกำจัดเซลล์และโปรตีนที่ได้จากแหล่งอื่น (2) ไฮโดรเจลสังเคราะห์ และ (3) เจลโปรตีนรีคอมบิแนนท์ที่ออกแบบทางวิศวกรรม

ถาม: การแยกความแตกต่างของออร์แกนอยด์แบบกำหนดทิศทางจะทำได้อย่างไร

การพัฒนาในระยะเริ่มต้นของการแยกตัวของเซลล์ต้นกำเนิดที่เหนี่ยวนำในออร์แกนอยด์ได้รับการควบคุมร่วมกันโดยเส้นทางการส่งสัญญาณหลายเส้นทาง การเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองต้องเติมปัจจัยการเจริญเติบโตเพื่อจำลองกิจกรรมของเส้นทางการส่งสัญญาณเหล่านี้ โดยชี้นำเซลล์ให้แยกตัวในทิศทางที่เฉพาะเจาะจง ตัวอย่างเช่น การเหนี่ยวนำด้วย Y27632 และ Activin A สามารถทำให้เซลล์ต้นกำเนิดของตัวอ่อน (ESC) หรือเซลล์ต้นกำเนิดพหุศักยภาพที่เหนี่ยวนำ (iPSC) แตกต่างกันเป็นเอ็มบริออยด์บอดี (EB) ในเวลาต่อมา เส้นทางการส่งสัญญาณได้รับการควบคุมโดยปัจจัยต่างๆ เช่น Wnt3a, FGF-4 และ Noggin เพื่อเหนี่ยวนำให้เซลล์ต้นกำเนิดแยกตัวในทิศทางที่เฉพาะเจาะจง

ถาม: เราจะหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนเมื่อได้รับตัวอย่างทางคลินิกได้อย่างไร?

(1) ให้แน่ใจว่าได้สุ่มตัวอย่างแบบปลอดเชื้อมากที่สุดเท่าที่จะทำได้ (2) ก่อนการสกัด ให้แช่ใน PBS ที่ประกอบด้วยยาปฏิชีวนะเป็นเวลาหลายนาที สำหรับเนื้องอกที่อยู่ในบริเวณที่อาจสัมผัสกับสิ่งแวดล้อมภายนอก เช่น กระเพาะอาหาร ลำไส้ และกระเพาะปัสสาวะ แนะนำให้แช่ใน PBS ที่ประกอบด้วยยาปฏิชีวนะ 3%-5% เป็นเวลา 5-10 นาที สำหรับเนื้องอกทั่วไปอื่นๆ ให้แช่ใน PBS ที่ประกอบด้วยยาปฏิชีวนะ 1%-2% เป็นเวลาประมาณ 5 นาที (3) สารเคมีทั้งหมดที่ใช้ในการสกัดเซลล์ควรประกอบด้วยยาปฏิชีวนะ 1% และยาปฏิชีวนะหลักในความเข้มข้นที่เหมาะสม

ถาม: ควรมีข้อควรระวังอะไรบ้างในการเก็บรวบรวม เก็บรักษา และขนส่งเนื้อเยื่อเนื้องอก?

รวบรวมเนื้อเยื่อเนื้องอกที่มีเซลล์เนื้องอกในปริมาณสูงให้ได้มากที่สุด และลดเวลาในการสัมผัสตัวอย่างเนื้อเยื่อกับอากาศให้เหลือน้อยที่สุดเพื่อลดโอกาสการปนเปื้อน ใส่ตัวอย่างเนื้อเยื่อเนื้องอกที่รวบรวมได้ลงในหลอดที่ปลอดเชื้อซึ่งบรรจุสารถนอมตัวอย่างพิเศษโดยเร็วที่สุด และขนส่งไปยังหน่วยทดสอบอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิต่ำ (ประมาณ 4°C) (พยายามส่งมอบภายใน 2~4 ชั่วโมงหลังจากการเก็บตัวอย่าง)

ถาม: มีความแตกต่างระหว่างออร์แกนอยด์ที่เพาะเลี้ยงจากรอยโรคและออร์แกนอยด์ที่เพาะเลี้ยงจากเนื้อเยื่อที่อยู่ติดกันหรือไม่?

ข้อกำหนดสำหรับไซต์การสุ่มตัวอย่างเนื้อเยื่อเนื้องอกคืออะไร? ใช่ มีความแตกต่าง เนื้องอกเองก็มีลักษณะไม่เหมือนกัน ดังนั้นจึงมักสังเกตเห็นความแตกต่างระหว่างออร์แกนอยด์ที่ได้จากแหล่งที่แตกต่างกัน ในทางสัณฐานวิทยา ออร์แกนอยด์ที่ได้จากรอยโรคหลักมักจะมีโครงสร้างที่รุกรานมากกว่าออร์แกนอยด์ที่ได้จากเนื้อเยื่อที่อยู่ติดกัน โดยทั่วไปแล้วจะมีลักษณะผิดปกติมากกว่า เพื่อลดข้อผิดพลาดในการสร้างแบบจำลองหรือการคัดกรองยา ควรเก็บตัวอย่างหลายๆ ตัวอย่างจากบริเวณที่มีกิจกรรมที่ดี

ถาม: สามารถใช้ยาประเภทใดในการทดสอบความไวของยาในออร์แกนอยด์ของเนื้องอกได้บ้าง?

ประเภทหลักของยาต้านเนื้องอกในทางคลินิกสามารถจำแนกออกเป็น 3 ประเภท คือ ยาต้านเซลล์ (เช่น แพคลีแท็กเซล, ซิสแพลติน/คาร์โบแพลติน, 5-FU เป็นต้น), ยาที่มุ่งเป้าไปที่ EGFR, HER2, VEGFR เป็นต้น) และยาภูมิคุ้มกันบำบัดที่เป็นสารยับยั้งจุดตรวจภูมิคุ้มกัน (แอนติบอดี PD-1, แอนติบอดี PD-L1 เป็นต้น)

ถาม: อัตราความสำเร็จของการเพาะ PDO คือเท่าไร?

อัตราความสำเร็จของการเพาะเลี้ยง PDO จะแตกต่างกันเล็กน้อยขึ้นอยู่กับแหล่งที่มา PDO ส่วนใหญ่มีอัตราความสำเร็จอยู่ระหว่าง 63% ถึง 70% หรืออาจสูงกว่านั้นถึง 90% ซึ่งส่วนใหญ่สัมพันธ์กับกิจกรรมของเนื้อเยื่อเอง นอกจากนี้ การรักษาทางคลินิกอาจส่งผลต่ออัตราความสำเร็จ อัตราความสำเร็จสามารถปรับปรุงได้โดยการลดเวลาของเนื้อเยื่อนอกร่างกายและขั้นตอนการผ่าตัด

ถาม: เนื้อเยื่อแช่แข็งสามารถนำไปใช้เพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ได้หรือไม่?

โดยทั่วไปไม่แนะนำให้แช่แข็งเนื้อเยื่อเนื่องจากการสูญเสียความสามารถในการมีชีวิตอย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตาม หากเก็บเนื้อเยื่อที่อุณหภูมิ -80°C ช่วงเวลาที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์คือภายใน 6 สัปดาห์หลังการเก็บรักษา หากเก็บเนื้อเยื่อในไนโตรเจนเหลว ช่วงเวลาในการเก็บรักษาอาจนานกว่านี้ได้ แต่ไม่ควรเกิน 6 เดือน

ถาม: ในการสกัดเซลล์หลัก โดยปกติจะมีไฟโบรบลาสต์ผสมอยู่ด้วย จะต้องจัดการอย่างไร?

(1) เนื่องจากการยึดเกาะของไฟโบรบลาสต์ไม่ดี จึงสามารถกำจัดออกได้ด้วยการยึดเกาะซ้ำ(2) สามารถใช้รีเอเจนต์กำจัดไฟโบรบลาสต์ได้ แต่ว่าจะส่งผลต่อการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์หรือไม่ ยังต้องมีการตรวจยืนยันในเชิงทดลอง

ถาม: ต้องใช้เนื้อเยื่อเนื้องอกเดิมเท่าใดจึงจะเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ของเนื้องอกได้ ตัวอย่างชิ้นเนื้อที่นำมาตรวจเพียงพอหรือไม่

โดยทั่วไปเนื้อเยื่อสำหรับการผ่าตัดควรมีขนาดใหญ่กว่าเมล็ดถั่วเหลือง 2-3 เมล็ด หากได้มาจากการตรวจชิ้นเนื้อด้วยเข็ม จำเป็นต้องใช้ตัวอย่างอย่างน้อย 2-3 ตัวอย่าง ในขณะที่การตรวจชิ้นเนื้อด้วยกล้องต้องตัดเนื้อเยื่อเนื้องอกอย่างน้อย 6 ชิ้นขึ้นไป

ถาม: หากตัวอย่างเนื้อเยื่อเนื้องอกมีขนาดเล็กเกินไป และจำนวนออร์แกนอยด์ที่เพาะเลี้ยงไม่เพียงพอสำหรับการทดสอบในภายหลัง ควรทำอย่างไร?

เนื่องจากออร์แกนอยด์ที่ได้จากแหล่งกำเนิดของเนื้องอกอาจแสดงลักษณะที่ต่างกันหลังจากผ่านการตรวจ จึงมักไม่แนะนำให้ผ่านการตรวจ โดยเอกสารแนะนำว่าควรจำกัดการผ่านการตรวจของออร์แกนอยด์ให้เหลือ 2-3 รุ่น โดยไม่เกิน 5 รุ่น หากจำนวนเซลล์น้อยเกินไปและไม่สามารถปฏิบัติตามข้อกำหนดในการทดสอบได้หลังจาก 5 รุ่น ให้พิจารณาเปลี่ยนวิธีการทดสอบ เช่น ใช้เพลท 384 หลุมขนาดเล็กกว่า หรือลองใช้ชิปไมโครฟลูอิดิกสำหรับการทดสอบ

ถาม: จะมีเซลล์ปกติอยู่ในเนื้อเยื่อเนื้องอกหรือไม่? เราจะกำจัดเซลล์ปกติเหล่านี้ได้อย่างไร?

อาจมีเซลล์ปกติจำนวนเล็กน้อย ประการแรก พยายามหลีกเลี่ยงการสุ่มตัวอย่างเนื้อเยื่อปกติระหว่างการเก็บตัวอย่าง ประการที่สอง หลังจากสกัดเซลล์หลักแล้ว อาจใช้การเรียงลำดับด้วยลูกปัดแม่เหล็กหรือการไหลของไซโตเมทรีสำหรับการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์เพิ่มเติม เมื่อมีเซลล์ปกติจำนวนน้อยมาก การสร้างแบบจำลองและการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ในภายหลังอาจไม่มีผลมากนัก ดังนั้นอาจไม่จำเป็นต้องนำออก

ถาม: เมื่อทำการสกัดเซลล์หลักจากเนื้อเยื่อเนื้องอก ทำไมเซลล์จึงปรากฏเป็นสีแดง?

เนื้อเยื่อในร่างกายมีเลือดไหลเวียนมาก จึงมีเม็ดเลือดแดงจำนวนมาก ในกรณีส่วนใหญ่ ไม่จำเป็นต้องผ่านกระบวนการใดๆ และไม่ส่งผลต่อการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ หากมีเม็ดเลือดแดงมากเกินไป สามารถรักษาด้วยบัฟเฟอร์ไลซิสก่อนการเพาะเลี้ยงได้อย่างเหมาะสม

ถาม: ในระหว่างการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ จะพบอนุภาคสีดำ จะกำจัดออกได้อย่างไร?

อนุภาคสีดำมักเป็นสิ่งสกปรกหรือเศษเซลล์ สามารถกำจัดออกได้ 2 วิธี:

ย่อยออร์แกนอยด์และล้างซ้ำๆ ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อเจือจางสิ่งเจือปน

ใช้มีดผ่าตัดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วตัดออร์แกนอยด์ออกเป็นสองส่วน จากนั้นใช้ไซริงค์ขนาด 1 มล. ที่บรรจุตัวกลางเพื่อชะล้างสิ่งสกปรกออกจากออร์แกนอยด์อย่างอ่อนโยน

ถาม: จำนวนครั้งในการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ มีการจำกัดหรือไม่ และสามารถทำได้กี่ครั้ง?

จำนวนการผ่านโดยทั่วไปจะขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของเซลล์ต้นทาง ออร์แกนอยด์ส่วนใหญ่สามารถผ่านในหลอดทดลองได้นานถึง 10 ครั้ง (>6 เดือน) การเลือกสภาวะการเพาะเลี้ยงอาจมีอิทธิพลบ้าง โดยโดยทั่วไปแล้วอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีเงื่อนไขจะดีกว่าอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีปัจจัยสังเคราะห์

ถาม: สามารถเพาะเลี้ยงเซลล์เนื้องอก (เช่น เซลล์ HepG2) ใน PDO ได้หรือไม่

PDO เป็นโครงสร้างที่ประกอบตัวเองอย่างซับซ้อน ระบบการเพาะเลี้ยง 3 มิติที่สร้างขึ้นจากสายเซลล์เดี่ยวไม่สามารถเรียกว่า PDO ได้ แต่เรียกง่ายๆ ว่าสถานะทรงกลม 3 มิติ

ถาม: เกณฑ์ในการผ่านออร์แกนอยด์มีอะไรบ้าง?

ขึ้นอยู่กับสถานะการพัฒนาของออร์แกนอยด์ เวลาจะแตกต่างกันไป โดยปกติอยู่ระหว่าง 5-10 วัน โดยมีเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 100-200 ไมโครเมตร ออร์แกนอยด์บางชนิดที่พัฒนาช้าอาจใช้เวลาหลายสัปดาห์จึงจะถึงสถานะการผ่านที่เหมาะสม

ถาม: จะนับจำนวนออร์แกนอยด์ที่มีชีวิตได้อย่างไร?

ระหว่างการทดลอง ให้นำสารละลาย Calcein-AM ที่เตรียมไว้ออกมาแล้วเติมสารละลาย Calcein-AM ลงในตัวกลางจนมีความเข้มข้นสุดท้าย 0.2 ไมโครโมลต่อลิตร ฟักที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 60 นาที เมื่อครบเวลาที่กำหนด ให้ล้างตัวกลางที่มี Calcein-AM ออกด้วย PBS อย่างช้าๆ แล้วเติมตัวกลางใหม่ลงไป ใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ที่มีความยาวคลื่นเร้า 490 นาโนเมตรและมีความยาวคลื่นการแผ่รังสี 515 นาโนเมตรเพื่อสังเกตและถ่ายภาพออร์แกนอยด์ ออร์แกนอยด์ที่มีชีวิตจะมีสีเขียวและมีขอบใส นับออร์แกนอยด์ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง >20 ไมโครเมตร

ถาม: คำนวณความสามารถในการมีชีวิตของออร์แกนอยด์ได้อย่างไร

ความสามารถในการมีชีวิตของออร์แกนอยด์คำนวณตามสูตร: X=(Nlive/Ntotal)×100% โดยที่: X แทนความสามารถในการมีชีวิตของออร์แกนอยด์ Nlive แทนจำนวนของออร์แกนอยด์ที่มีชีวิต Ntotal แทนจำนวนทั้งหมดของออร์แกนอยด์

ถาม: มีวิธีการใดบ้างในการระบุออร์แกนอยด์?

วิธีการที่พื้นฐานที่สุดคือการสังเกตสัณฐานวิทยาของออร์แกนอยด์ผ่านกล้องจุลทรรศน์และทำการย้อม H&E วิธีการอื่นๆ ได้แก่ Western Blot, qRT-PCR, immunofluorescence, flow cytometry เพื่อตรวจจับว่าออร์แกนอยด์แสดงไบโอมาร์กเกอร์ที่สอดคล้องกันหรือไม่ การจัดลำดับพันธุกรรมสามารถระบุการจับคู่ทางพันธุกรรมระหว่างออร์แกนอยด์ที่เพาะเลี้ยงกับเนื้อเยื่อต้นทางได้ สำหรับออร์แกนอยด์บางชนิด สามารถทำการทดสอบการทำงานเพื่อดูว่าออร์แกนอยด์มีหน้าที่เฉพาะหรือไม่ ตัวอย่างเช่น การศึกษาวิจัยแสดงให้เห็นว่าออร์แกนอยด์ในกระเพาะอาหารสามารถหลั่งกรดในกระเพาะอาหารได้ และออร์แกนอยด์ในหัวใจสามารถเต้นได้เอง

ถาม: เซลล์ปกติสามารถเจริญเติบโตเป็นออร์แกนอยด์ได้หรือไม่? จะกำจัดออร์แกนอยด์ปกติออกระหว่างการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ของเนื้องอกได้อย่างไร?

เซลล์ปกติสามารถเจริญเติบโตเป็นออร์แกนอยด์ได้เช่นกัน วิธีการกำจัดออร์แกนอยด์ปกติ ได้แก่ (1) การคัดเลือกด้วยมือโดยอิงตามผลการย้อม HE ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ (2) การทำให้ PDO บริสุทธิ์โดยปรับองค์ประกอบของอาหารเลี้ยงเชื้อ (เช่น ปัจจัยการเจริญเติบโต/สารยับยั้งโมเลกุลขนาดเล็ก) (3) การกระจาย PDO ให้เป็นเซลล์เดี่ยวสำหรับไซโตเมทรีแบบไหลหรือการเรียงลำดับด้วยลูกปัดแม่เหล็ก

ถาม: ในระหว่างการทดลองความไวต่อยา จำเป็นต้องย่อย PDO จากเจลเมทริกซ์หรือไม่?

ไม่ PDO ต้องมีโครงสร้างสามมิติเพื่อจำลองสภาวะในร่างกาย หากไม่มีการสนับสนุนจากเจลเมทริกซ์ ความแม่นยำของการทดลองความไวต่อยาจะได้รับผลกระทบ โดยทั่วไป ยาที่ละลายน้ำได้สามารถทะลุผ่านเจลเมทริกซ์เพื่อออกฤทธิ์กับออร์แกนอยด์ได้ แต่เมื่อทำการทดลองภูมิคุ้มกันเซลล์เคมี จำเป็นต้องเอาเจลเมทริกซ์ออก

ถาม: การทดลอง PDO สามารถแทนที่การทดลองสัตว์ (PDX) ได้อย่างสมบูรณ์หรือไม่?

PDO สามารถทดแทน PDX ได้บางส่วน แต่ไม่สามารถทดแทน PDX ได้อย่างสมบูรณ์

ถาม: สาเหตุที่ทำให้ PDO เติบโตผิดปกติในระหว่างการเพาะปลูก คือ มีวงจรการเจริญเติบโตที่สั้นลงและแพร่พันธุ์อย่างรวดเร็วเมื่อเทียบกับสภาวะก่อนหน้านี้ คืออะไร?

ปัจจัยภายนอก: (1) ความผิดปกตินี้อาจเกิดจากการเจริญเติบโตของเซลล์ที่ปนเปื้อนบางชนิด เช่น ไฟโบรบลาสต์ ในกรณีดังกล่าว ขอแนะนำให้ทำการย้อมและสังเกตเพื่อยืนยันการมีอยู่ของเซลล์ที่ปนเปื้อนเหล่านี้ จากนั้นจึงดำเนินการกำจัดเซลล์เหล่านี้ (2) การเปลี่ยนแปลงในสภาวะการเพาะเลี้ยง รวมถึงการเพิ่มปัจจัยหรือโมเลกุลขนาดเล็กบางชนิด อาจทำให้เส้นทางการแพร่กระจายของ PDO เพิ่มมากขึ้น

ปัจจัยภายใน : การกลายพันธุ์ทางพันธุกรรมที่อาจเกิดขึ้น เพื่อตรวจสอบสิ่งนี้ ขอแนะนำให้ทำการจัดลำดับ และควรเปรียบเทียบผลลัพธ์กับผลลัพธ์ของ PDO หลัก เพื่อตรวจสอบว่ามีการกลายพันธุ์ทางพันธุกรรมหรือไม่

ถาม: ความไวของ PDO ต่อยาสามารถทดสอบได้อย่างไร?

สามารถทดสอบความไวของยา PDO ได้โดยใช้เทคนิคต่างๆ เช่น การวิเคราะห์ CCK8 การวิเคราะห์ความมีชีวิตของเซลล์ด้วย ATP และการย้อมสีแบบมีชีวิต/ตาย การประเมินกิจกรรม ATP ของออร์แกนอยด์ของเนื้องอกเป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปที่สุด ATP เป็นโมเลกุลพลังงานที่สำคัญที่สุดในเซลล์และสามารถใช้วัดระดับการเผาผลาญของเซลล์ ซึ่งสะท้อนถึงจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตได้ จากผลของการให้ยาต่อปริมาณ ATP ในเซลล์ ค่า IC50 (ความเข้มข้นยับยั้งครึ่งหนึ่งของค่าสูงสุดของยาที่ทดสอบ) สำหรับยาแต่ละสูตรสามารถคำนวณได้โดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์เพื่อเลือกยาที่มีประสิทธิภาพสูงสุดสำหรับการยับยั้งเนื้องอก

ถาม: ช่วงความเข้มข้นสำหรับการทดลองความไวของยา PDO เท่ากันกับเซลล์เนื้องอกหลักหรือไม่

ไม่เหมือนกัน โดยทั่วไปความเข้มข้นของยาสำหรับ PDO จะต้องสูงกว่าสำหรับเซลล์หลัก สามารถทำการทดลองเบื้องต้นเพื่อวิเคราะห์ความเข้มข้นที่เหมาะสมสำหรับการทดลองความไวต่อยาอย่างเป็นทางการ

ถาม: ควรใช้ organoids ในระยะการเจริญเติบโตใดสำหรับการทดสอบยา?

โดยทั่วไปแนะนำให้ใช้ออร์แกนอยด์ภายใน 5 ขั้นตอนสำหรับการทดสอบยา ในระยะนี้ ออร์แกนอยด์จะแสดงความเสถียรและการทำงานที่ดีที่สุด

ถาม: เกณฑ์ในการพิจารณาความสำเร็จในการจัดตั้งออร์แกนอยด์มีอะไรบ้าง?

(1) การประเมินเบื้องต้น: การเปลี่ยนแปลงสัณฐานวิทยาออร์แกนอยด์จากสถานะเซลล์เป็นรูปแบบต่างๆ เช่น ช่องว่าง การแตกหน่อ การรวมตัว หรือการแยกตัว (2) การระบุการแสดงออกของไบโอมาร์กเกอร์เฉพาะ ซึ่งควรจะคล้ายกับการกระจายในชิ้นเนื้อเยื่อ สามารถดำเนินการวิเคราะห์ลำดับเพิ่มเติมเพื่อการเปรียบเทียบโดยละเอียดมากขึ้น

ถาม: การเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์แตกต่างจากการเพาะเลี้ยงเซลล์ปกติอย่างไร?

(1) วิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่แตกต่างกัน: ออร์แกนอยด์ต้องการการสนับสนุนจากสารตั้งต้นหรือโครงสร้างเชิงพื้นที่เพื่อรักษาโครงสร้างสามมิติของมันไว้ ในขณะที่การเพาะเลี้ยงเซลล์ปกติไม่จำเป็นต้องทำเช่นนี้ (2) การเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ต้องบรรลุการแยกตัวและการประกอบตัวเองแบบ ex vivo ดังนั้นจึงต้องใช้ไซโตไคน์ต่างๆ ร่วมกันเพื่อเหนี่ยวนำ ส่งผลให้มีส่วนประกอบของอาหารเลี้ยงเชื้อที่ค่อนข้างซับซ้อน การเพาะเลี้ยงเซลล์ปกติมักจะเกี่ยวข้องกับเซลล์ประเภทเดียวเท่านั้น ดังนั้น ส่วนประกอบของอาหารเลี้ยงเชื้อจึงค่อนข้างเรียบง่าย(3) แหล่งเซลล์ที่แตกต่างกัน: ออร์แกนอยด์ได้มาจากเซลล์เยื่อบุผิวที่มีศักยภาพหลายประการ ในขณะที่การเพาะเลี้ยงเซลล์ปกติเหมาะสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่เลือกประเภทต่างๆ

ถาม: ฉันจะตรวจสอบได้อย่างไรว่าทรงกลม 3 มิติที่ฉันเพาะเลี้ยงเป็นออร์แกนอยด์หรือไม่ และสอดคล้องกับเนื้อเยื่อเป้าหมายหรือไม่

วิธีการระบุออร์แกนอยด์ ได้แก่ การย้อม H&E ภูมิคุ้มกันเนื้อเยื่อ (IHC) การจัดลำดับเซลล์เดี่ยว และอื่นๆ จำเป็นต้องทำการตัดสินแบบหลายมิติจากมุมมองทางสัณฐานวิทยา พยาธิวิทยา และพันธุกรรมระดับโมเลกุล เพื่อพิจารณาว่าออร์แกนอยด์สอดคล้องกับอวัยวะหรือเนื้อเยื่อเป้าหมายหรือไม่ สำหรับออร์แกนอยด์ของเนื้องอก สามารถใช้การตรวจหาไบโอมาร์กเกอร์เฉพาะเพื่อยืนยันได้

ถาม: หากสัณฐานวิทยาของออร์แกนอยด์ที่สังเกตได้ระหว่างการเพาะเลี้ยงแตกต่างไปจากที่รายงานไว้ในเอกสาร สาเหตุอาจมาจากอะไร?

ประการแรก ความแตกต่างและความไม่เป็นเนื้อเดียวกันของตัวอย่างแหล่งและชนิดย่อยอาจมีอยู่ ประการที่สอง ความแตกต่างในคุณภาพของไซโตไคน์ที่เลือกและสารยับยั้งโมเลกุลขนาดเล็กบางชนิดที่ใช้ในการเหนี่ยวนำอาจนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงในสัณฐานวิทยาการแยกตัวของออร์แกนอยด์ที่แตกต่างกัน แนะนำให้ยืนยันความสอดคล้องระหว่างสัณฐานวิทยาของออร์แกนอยด์และเนื้อเยื่อแหล่งโดยใช้วิธีการต่างๆ เช่น การย้อม HE, IHC และการจัดลำดับพันธุกรรม แทนที่จะพึ่งพาคำอธิบายทางวรรณกรรมเพียงอย่างเดียว

ถาม: เมื่อทำการทดลองความไวต่อยาด้วยออร์แกนอยด์ จำเป็นต้องควบคุมปริมาณ DMSO ที่ใช้เป็นตัวทำละลายสำหรับยาหรือไม่

ใช่ โดยทั่วไปการทดลองความไวต่อยาต้องใช้ปริมาณเปอร์เซ็นต์ของ DMSO น้อยกว่า 0.5%

ถาม: เราจะนำออร์แกนอยด์ออกจากเจลเมทริกซ์ได้อย่างไร?

ขอแนะนำวิธีการดังต่อไปนี้: (1) สามารถใช้สารละลายฟื้นฟูออร์แกนอยด์ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ (CAT#41421ES) เพื่อรับเซลล์ที่ถูกแขวนลอยอย่างอ่อนโยนและมีประสิทธิภาพโดยไม่ทำลายเซลล์หรือโปรตีนบนพื้นผิวเซลล์ (2) สามารถละลายเจลเมทริกซ์ที่อุณหภูมิต่ำเพื่อให้เจลนิ่มลงและปลดปล่อยออร์แกนอยด์

ถาม: ออร์แกนอยด์หลายชนิดจะเกาะติดกับผนังของหลอดเหวี่ยงระหว่างการฟื้นตัว เราจะปรับปรุงอัตราการฟื้นตัวได้อย่างไร

เมื่อทำการปั่นเหวี่ยงหลังจากเก็บรวบรวม ให้ใช้เครื่องปั่นเหวี่ยงโรเตอร์แนวนอนและเพิ่มความเร็วในการปั่นเหวี่ยงให้เหมาะสม โดยทั่วไป แรงเหวี่ยงที่เหมาะสมคือประมาณ 300g และความเร็วรอบประมาณ 1,000-1,200 รอบต่อนาที