1. ผลผลิตการถอดเสียงต่ำ

คุณภาพของเทมเพลตมีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับผลผลิต หากผลผลิตของกลุ่มทดลองต่ำกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ สาเหตุที่เป็นไปได้คือ:

① เทมเพลตการทดลองมีส่วนประกอบที่เป็นสารยับยั้ง

② เทมเพลตมีบางอย่างผิดปกติ

ข้อเสนอแนะ:

① ทำการทำความสะอาดเทมเพลตอีกครั้ง

② กำหนดปริมาณเทมเพลตและความสมบูรณ์ของเทมเพลต

③ ขยายเวลาตอบสนอง;

④ เพิ่มจำนวนอินพุตเทมเพลต

⑤ ลองใช้โปรโมเตอร์และ RNA โพลิเมอเรสอื่น

2. ผลผลิตของบันทึกย่อสั้นต่ำ

ชิ้นส่วนเริ่มต้นการถอดรหัสที่สั้นจะยับยั้งปฏิกิริยา เมื่อผลิตภัณฑ์การถอดรหัสมีค่าน้อยกว่า 100 nt การขยายเวลาปฏิกิริยาเป็น 4-8 ชั่วโมงหรือเพิ่มปริมาณเทมเพลตเป็น 2 μg จะเพิ่มผลผลิต RNA

3. ความยาวของรหัสถอดรหัส RNA มากกว่าที่คาดไว้

หากการวิเคราะห์ทางอิเล็กโทรโฟเรซิสแสดงให้เห็นว่าแถบผลิตภัณฑ์มีขนาดใหญ่กว่าขนาดที่คาดไว้ สาเหตุที่เป็นไปได้คือ:

①เทมเพลตพลาสมิดอาจไม่เป็นเชิงเส้นอย่างสมบูรณ์

②ปลาย 3' ของสายเซนส์มีโครงสร้างที่โดดเด่น

③RNA มีโครงสร้างรองที่ยังไม่ถูกเปลี่ยนแปลงสภาพโดยสมบูรณ์

ข้อเสนอแนะ:

① ตรวจสอบว่าเทมเพลตได้รับการสร้างเชิงเส้นอย่างสมบูรณ์หรือไม่ และหากจำเป็น ให้ดำเนินการสร้างเชิงเส้นเพิ่มเติม

② เลือกเอนไซม์จำกัดที่เหมาะสมเพื่อหลีกเลี่ยงส่วนยื่น 3' หรือใช้ Klenow Fragment/T4 DNA polymerase เพื่อทำการถอดรหัสให้เสร็จสิ้นก่อนดำเนินการต่อ

③ใช้เจลที่ทำให้เสียสภาพเพื่อตรวจจับผลิตภัณฑ์ RNA

4. ความยาวของรหัสถอดรหัส RNA น้อยกว่าที่คาดไว้

หากการวิเคราะห์ทางอิเล็กโทรโฟเรซิสแสดงให้เห็นว่าแถบผลิตภัณฑ์มีขนาดเล็กกว่าขนาดที่คาดไว้ สาเหตุที่เป็นไปได้คือ:

①เทมเพลตประกอบด้วยลำดับการสิ้นสุดที่คล้ายกับโพลีเมอเรส RNA ของ T7

②เนื้อหา GC ในเทมเพลตมีสูง

ข้อเสนอแนะ:

①ลดอุณหภูมิปฏิกิริยา (เช่น 30°C) บางครั้งการลดอุณหภูมิอาจเพิ่มความยาวของการถอดรหัสได้ แต่ผลผลิตจะลดลง หรือลองใช้ RNA polymerase อื่นในการถอดรหัส

②หากเนื้อหา GC ของเทมเพลตสูง ให้ใช้ 42℃ เพื่อถอดรหัสหรือเพิ่ม SSB เพื่อเพิ่มผลผลิตและความยาวในการถอดรหัส

5. การแยกส่วนผลิตภัณฑ์การถอดรหัสด้วยไฟฟ้า

เกิดปรากฏการณ์หางไหลระหว่างอิเล็กโทรโฟเรซิส

สาเหตุที่เป็นไปได้:

①ปนเปื้อนด้วย RNase ในระหว่างการดำเนินการทดลอง

②เทมเพลต DNA ที่ปนเปื้อนโดย RNase

ข้อเสนอแนะ:

①ใช้ปลายปิเปตและหลอด EP ที่ปราศจาก RNase สวมถุงมือและหน้ากากลาเท็กซ์แบบใช้แล้วทิ้ง และเตรียมสารเคมีทั้งหมดด้วย H2O ที่ปราศจาก RNase

② ทำให้ DNA เทมเพลตบริสุทธิ์อีกครั้ง

[1] ตง Z, เจิ้ง N, Hu C, และคณะNosema bombycis microRNA-like RNA 8 (Nb-milR8) เพิ่มความสามารถในการก่อโรคของเชื้อราโดยปรับเปลี่ยนการแสดงออกของยีน BmPEX16 ในโฮสต์ของมัน Bombyx mori. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)

[2] Wang X, Tang S, Ye S และคณะ การวัดปริมาณ miR-195-5p ที่ไหลเวียนด้วยปฏิกิริยาขยายแบบเรียงซ้อนของสายสามสาย Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)