ไฮฟ์^™ เซลล์ด่วนโดยตรง ชุด RT-qPCR ที่ใช้สีย้อม SYBR Green เหมาะสำหรับการสกัด RNA จากเซลล์สัตว์ทุกชนิด (เช่น เซลล์ผนังเซลล์และเซลล์แขวนลอย เซลล์เพาะเลี้ยงขั้นต้น เซลล์ต้นกำเนิดต่างๆ เซลล์ iPS เป็นต้น) โดยไม่จำเป็นต้องสกัด RNA และสามารถใช้โดยตรงสำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของ qPCR ซึ่งใช้เวลาสั้น ใช้งานง่าย และมีอัตราข้อผิดพลาดต่ำ ใช้เวลาเพียง 1.5 ชั่วโมงในการดำเนินการตามขั้นตอนตั้งแต่การเตรียมเทมเพลตไปจนถึงปฏิกิริยาการถอดรหัสย้อนกลับและการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน

ชุดทดสอบนี้ประกอบด้วยสารเคมีสำหรับการถอดรหัสย้อนกลับและการตรวจจับการเรืองแสง ซึ่งสามารถใช้สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนโดยไม่จำเป็นต้องซื้อสารเคมีเพิ่มเติม

ข้อมูลจำเพาะ

ส่วนประกอบ

พื้นที่จัดเก็บ

บัฟเฟอร์ไลซิส FCD และบัฟเฟอร์ล้าง FCD ถูกหลอมละลายและเก็บไว้ที่ 4°C เพื่อป้องกันการปนเปื้อน ควรเก็บ FCD Stop Solution、DNase I、4× Hifair™ FCD RT Mix、2× Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Mix ที่อุณหภูมิ -25~-15℃

คำแนะนำ

1. การเตรียมผลิตภัณฑ์สำหรับการแยกส่วน

1)1. ละลายสารเคมีที่อุณหภูมิห้อง คว่ำลงและผสมเบาๆ ก่อนใช้ และใช้หลังจากการปั่นเหวี่ยงเล็กน้อยเพื่อหลีกเลี่ยงการเกิดฟอง*

*การไม่สามารถผสมสารเคมี การใช้เครื่องกำเนิดสัญญาณในการผสม และความล้มเหลวในการกำหนดค่าสารเคมีบนน้ำแข็งอาจทำให้ประสิทธิภาพของปฏิกิริยาลดลง

2) ขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์** ให้ย้ายเซลล์ไปยังหลอดเหวี่ยงและเหวี่ยงที่ 5,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 2 นาทีเพื่อรวบรวมเซลล์และดูดตัวกลางออกจากหลุม หากเพาะเลี้ยงเซลล์ในจาน 96 หลุม ก็สามารถดูดตัวกลางออกได้โดยตรง

3) เติมบัฟเฟอร์ล้าง FCD 150 μL ลงในแต่ละหลุม ล้างเซลล์ด้วยการเป่าลม ปั่นเหวี่ยงที่ 5,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 2 นาที และดูดบัฟเฟอร์ล้าง FCD ออก***

4) เติมสารละลายบัฟเฟอร์ไลซิส FCD 48 μL และสารละลาย DNase Ⅰ 2 μL ลงในแต่ละหลุม เป่าและผสมที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นปล่อยทิ้งไว้ 5 นาที แล้วจึงเติม 25 μL ของ FCD Stop Solution หลังจากฟัก**** จากนั้นเป่าและผสมประมาณ 5 ครั้งเพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์จากการแยก*****

- ข้อกำหนดพื้นฐานสำหรับจำนวนเซลล์คือ 1 × 10⁴ เซลล์ต่อหลุม และชุดนี้ใช้งานได้ในช่วง 1 × 10³ - 1 × 10⁶ เซลล์ หากจำนวนเซลล์มากขึ้น สามารถเพิ่มปริมาณสารละลาย FCD Lysis Buffer และสารละลาย DNaseⅠ ได้ตามสัดส่วนที่เหมาะสม

- เงื่อนไขในการปั่นเหวี่ยงแตกต่างกันไปตามเซลล์ ดังนั้น โปรดปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็วที่เหมาะสมกับเซลล์ที่กำลังใช้

**** เติม FCD Stop Solution ปริมาณ 2.5 μL ลงในไลเสท 50 μL และเพิ่มปริมาณ FCD Stop Solution ตามความจำเป็น

- หากต้องการจัดเก็บสารละลายผลิตภัณฑ์ไลซิสเซลล์ในระยะยาว ควรวางไว้ที่อุณหภูมิ -20°C

5）ละลายส่วนผสม Hifair™ FCD RT จำนวน 4 x ที่อุณหภูมิห้องแล้วผสมโดยพลิกกลับเล็กน้อย วางบนน้ำแข็งและกำหนดค่าระบบปฏิกิริยาตามตารางด้านล่าง:

*******ระดับการใช้ที่แนะนำคือ 2-5 μL พยายามอย่าให้เกิน 45%

1. การถอดความย้อนกลับ

ปิเปตและผสมสารละลายปฏิกิริยาที่เตรียมไว้ข้างต้นเบาๆ และทำปฏิกิริยาถอดรหัสย้อนกลับตามขั้นตอนในตารางด้านล่าง:

- อุณหภูมิการถอดรหัสย้อนกลับที่แนะนำคือ 55°C สำหรับเทมเพลตที่มีเนื้อหา GC สูงหรือเทมเพลตที่ซับซ้อน อุณหภูมิการถอดรหัสย้อนกลับสามารถเพิ่มเป็น 60°C ได้ ผลิตภัณฑ์การถอดรหัสย้อนกลับสามารถใช้โดยตรงสำหรับการตรวจจับ RT-qPCR ปลายทาง เพื่อหลีกเลี่ยงการยับยั้งปฏิกิริยา qPCR โดยระบบการถอดรหัสย้อนกลับและเพื่อให้ได้ค่า Ct ที่เหมาะสม (10-35) สามารถเจือจางผลิตภัณฑ์ 10-1000 เท่าแล้วจึงนำไปใช้ หากไม่ได้ทำการทดลองปลายทางเป็นเวลาสั้นๆ สามารถวางไว้ที่อุณหภูมิ -20℃ เพื่อการเก็บรักษา

1. ฟลูออเรสเซนต์เชิงปริมาณ PCR

1）ปฏิกิริยา ระบบ การกำหนดค่า

อัตราส่วนต่อไปนี้แนะนำสำหรับการเตรียมสารละลายปฏิกิริยา (เตรียมบนน้ำแข็ง)

*ห้ามเติมผลิตภัณฑ์ถอดรหัสย้อนกลับเกิน 1/10 ของปริมาตร RT-qPCR ความเข้มข้นของเทมเพลตที่สูงจะนำไปสู่การขยายแบบไม่จำเพาะได้ง่าย ควรเจือจางอย่างเหมาะสม 5-50 เท่า ปริมาณเทมเพลตที่แนะนำคือ 4 μL พยายามอย่าเกิน 6 μL เมื่อประสิทธิภาพของปฏิกิริยาไม่ดี สามารถปรับความเข้มข้นของไพรเมอร์ได้ในช่วง 0.2-1.0 μmol/L

2）ขั้นตอนการขยายปริมาณ PCR เชิงปริมาณฟลูออเรสเซนต์ (วิธีสองขั้นตอน)

3）ขั้นตอนการขยายอย่างรวดเร็วสำหรับ PCR เชิงปริมาณเรืองแสง (วิธีสองขั้นตอน)

- อุณหภูมิการอบอ่อน/การยืดตัวและเวลาการยืดตัวขั้นสุดท้ายสามารถปรับได้ตามข้อกำหนดของการทดลอง โปรแกรมแบบรวดเร็วเหมาะสำหรับยีนส่วนใหญ่ และสามารถทดลองใช้โปรแกรมมาตรฐานสำหรับยีนที่มีโครงสร้างรองที่ซับซ้อนแต่ละตัวได้

หมายเหตุ

1. ผลิตภัณฑ์นี้ใช้เพื่อการวิจัยเท่านั้น
2. โปรดปฏิบัติงานโดยสวมเสื้อคลุมแล็บและถุงมือแบบใช้แล้วทิ้ง เพื่อความปลอดภัยของคุณ

เวอร์ชั่นEN20230908

เอกสาร:

คู่มือการใช้งาน

11172-Hieff™ เซลล์ส่งตรงอย่างรวดเร็ว EN20230908.pdf