ชุด Hieff Superfast DNA Methylation Bisulfite (แบบคอลัมน์) เปลี่ยนไซโตซีนที่ไม่ได้รับการเมทิลเลชั่นในตัวอย่าง DNA ให้เป็นยูราซิลอย่างรวดเร็ว ในขณะที่ไซโตซีนที่ถูกเมทิลเลชั่นยังคงไม่เปลี่ยนแปลง ในระหว่างการบำบัดไบซัลไฟต์ที่อุณหภูมิสูง ดีเอ็นเอสายคู่จะเปลี่ยนสภาพเป็นสายเดี่ยว ในสภาพที่มี HSO3- ไซโตซีนที่เหลือจะผ่านกระบวนการดีอะมิเนชันและแปลงเป็นยูราซิล โดยไซโตซีนที่ถูกเมทิลเลชั่นจะยังคงไม่เปลี่ยนแปลง ในการขยาย PCR ในภายหลัง ยูราซิลจะถูกแทนที่ด้วยไทมีน (T) กระบวนการแปลงใช้เวลาเพียง 5 นาที รองรับอินพุต DNA ตั้งแต่ 100 pg ถึง 2 μg และบรรลุประสิทธิภาพการแปลง ≥99% สำหรับไซโตซีนที่ไม่ได้รับการเมทิลเลชั่น ดีเอ็นเอที่แปลงแล้วเหมาะสำหรับการใช้งานปลายทาง เช่น การขยาย PCR และการจัดลำดับ NGS

คุณสมบัติ

อินพุตต่ำ: เหมาะสำหรับการแปลงตัวอย่างตั้งแต่ 100 pg ถึง 2 μg

เวลาแปลงสั้น: ประมาณ 5 นาที.

ความเสียหายของตัวอย่างขั้นต่ำ: รักษาความสมบูรณ์ของตัวอย่างที่ดีหลังการแปลง

ประสิทธิภาพการแปลงสูง: อัตราการแปลง ≥99% อัตราการแปลงสูงในภูมิภาค GC สูงโดยมีอัตราการบวกปลอมต่ำ

เหมาะสำหรับตัวอย่างที่หายาก เช่นการแปลงเมทิลเลชันของดีเอ็นเอเซลล์เดี่ยว

มีความสามารถในการแปลงเมทิลเลชันของตัวอย่าง RNA

ผลิตภัณฑ์ ส่วนประกอบ

บันทึก:

สำหรับการทดสอบ 10 ครั้งต่อกล่อง: เติมเอธานอลไร้น้ำ 4.4 มิลลิลิตรลงในสารละลายล้าง

สำหรับการทดสอบ 50 ครั้งต่อกล่อง: เติมเอธานอลไร้น้ำ 22 มล. ลงในสารละลายล้าง

หลังจากเติมเอธานอลที่ปราศจากน้ำแล้ว ให้พลิกกลับและผสมให้เข้ากัน จากนั้นจัดเก็บไว้เพื่อใช้ในอนาคต ตรวจสอบให้แน่ใจว่าปิดฝาขวดให้แน่นเพื่อป้องกันการระเหยของเอธานอล ซึ่งอาจส่งผลต่อประสิทธิภาพของรีเอเจนต์ได้

รูป

รูปที่ 4 การแปลงบิสซัลไฟต์ในตัวอย่างดีเอ็นเอจีโนมของมนุษย์ดำเนินการโดยใช้ชุดแปลง 12225 และ Q ของคู่แข่ง จากนั้นจึงใช้ชุดเตรียมไลบรารีดีเอ็นเอสายเดี่ยวเฉพาะเมทิลเลชันเพื่อสร้างไลบรารี ข้อมูลผลผลิตและการควบคุมคุณภาพไลบรารีแสดงไว้ด้านบน ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าเมื่อจัดลำดับไลบรารีที่รวมมาจากชุด 12225 และ Q ของคู่แข่ง ชุด 12225 ให้ผลลัพธ์ข้อมูลที่สูงขึ้น มีอัตราส่วนเป้าหมายที่สูงขึ้น (%) และแสดงอัตราการทำซ้ำที่ต่ำกว่า (%)

การขนส่งและการเก็บรักษา

เก็บสารละลายแปลง 12225-A ไว้ที่อุณหภูมิห้อง ป้องกันไม่ให้โดนแสง เก็บส่วนประกอบอื่นๆ ไว้ที่อุณหภูมิห้อง อายุการเก็บรักษาคือ 12 เดือน

บันทึก:

1. เพื่อให้แน่ใจว่าการทดลองต่อเนื่องจะประสบความสำเร็จ ควรวัดปริมาณ DNA ทั้งหมดที่ป้อนเข้าในขั้นตอนการแปลงอย่างแม่นยำ ขอแนะนำให้ใช้ Qubit 3.0/4.0 สำหรับการวัดปริมาณ DNA โดยมีอัตราส่วน A260/A280 อยู่ระหว่าง 1.7 ถึง 1.9 ช่วง DNA ที่ป้อนเข้าควรอยู่ระหว่าง 100 pg ถึง 2 μg โดยมีช่วงที่เหมาะสมคือ 100 ng ถึง 1 μg อินพุต DNA ที่ไม่เพียงพออาจขัดขวางการตรวจจับต่อเนื่อง ในขณะที่อินพุตที่มากเกินไปอาจลดประสิทธิภาพการกู้คืนและการแปลง

2. สารละลายแปลง สารละลายดีซัลโฟเนชัน และสารละลายซักฟอกประกอบด้วยส่วนประกอบที่ระเหยได้ หลังจากใช้งาน ให้ปิดฝาให้แน่นทันทีและเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง

3. สำหรับตัวอย่างหลังการแปลง ให้ดำเนินการทดลองตามขั้นตอนทันที สำหรับการจัดเก็บในระยะสั้น ให้เก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°C และสำหรับการจัดเก็บในระยะยาว ให้เก็บไว้ที่อุณหภูมิ -80°C

4. เพื่อความปลอดภัยและสุขภาพของคุณ โปรดสวมเสื้อคลุมแล็บและถุงมือแบบใช้แล้วทิ้งในระหว่างการผ่าตัด

5. ผลิตภัณฑ์นี้ใช้เพื่อการวิจัยเท่านั้น!

คำแนะนำ

การเตรียมสารเคมีและวัสดุสิ้นเปลือง: หลอดเซนตริฟิวจ์ปลอดเชื้อขนาด 1.5 มล., น้ำปราศจากเอนไซม์, เอธานอลบริสุทธิ์, หลอด PCR

ล การแปลงบิสซัลไฟต์:

1) เตรียมหลอด PCR ปราศจากเชื้อที่สอดคล้องกันตามจำนวนตัวอย่างที่ต้องการทดสอบ และเตรียมระบบปฏิกิริยาตามตารางต่อไปนี้:

2) ระบบแปลงร่าง

ใช้ปิเปตเป่าและผสมระบบข้างต้นหรือเครื่องปั่นน้ำวน แล้วผสมเป็นเวลา 5 วินาที จากนั้นปั่นเหวี่ยงเป็นเวลาสั้นๆ แล้วปั่นสารละลายปฏิกิริยาไปที่ก้นหลอด PCR

วี หมายเหตุ: 1. ในขณะนี้ ปริมาตรรวมของสารละลายปฏิกิริยาในหลอด PCR คือ 200 μL เพื่อให้การแปลงสมบูรณ์ยิ่งขึ้น ควรแบ่งสารละลายปฏิกิริยาออกเป็นส่วนเท่าๆ กันและถ่ายโอนไปยังหลอด PCR ปลอดเชื้อหลอดใหม่หลังจากเป่าและผสมในขั้นตอนที่ 2) และควรดำเนินขั้นตอนการแปลง หลังจากการแปลงแล้ว สารละลายปฏิกิริยาในหลอด PCR ทั้งสองหลอดจะถูกผสมเข้าในคอลัมน์การทำให้บริสุทธิ์เดียวกันสำหรับการทำให้บริสุทธิ์

2. หากปริมาตรตัวอย่างอยู่ระหว่าง 20 ถึง 40 μL ให้ลดปริมาตรของสารละลายแปลงสภาพเพื่อรักษาปริมาตรรวมไว้ที่ 200 μL

3. หากปริมาตรตัวอย่างคือ 50 μL จะเติมสารละลายแปลงสภาพ 150 μL ปริมาตรรวมจะคงอยู่ที่ 200 μL และเวลาการแปลงสภาพจะขยายเป็น 6-10 นาที

3) การตั้งค่าโปรแกรมแปลง CT

วางท่อ PCR บนอุปกรณ์ PCR พร้อมโปรแกรมที่ตั้งไว้ล่วงหน้าเพื่อดำเนินการปฏิกิริยา

ล การชำระล้าง

1) ทีถ่ายโอน 200 μL ของ การแปลง วิธีแก้ไข พีคอลัมน์ยูริฟิเคชั่นส,เครื่องเหวี่ยง 30-60 วินาที 13000 จีทิ้งสารกรองแล้วใส่คอลัมน์การฟอกลงใน ซีท่อดูดส อีกครั้ง;

2) เติม 100 μL ของ บัฟเฟอร์ล้าง เข้าไปข้างใน คอลัมน์การฟอกอากาศ (ยืนยันว่าได้เติมเอธานอลบริสุทธิ์แล้ว) ปั่นเหวี่ยง 30-60 วินาที 13000 จีทิ้งสารกรองแล้วใส่คอลัมน์การฟอกลงใน ซีท่อดูดส อีกครั้ง;

3) เติม 200 μL ของ บัฟเฟอร์ดีซัลโฟเนชัน เข้าไปใน คอลัมน์การฟอกอากาศ และปล่อยให้ปฏิกิริยาอยู่ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 นาที หลังจากปฏิกิริยาเสร็จสิ้น ให้เหวี่ยงเป็นเวลา 30-60 วินาที 13000 จีทิ้งสารกรองแล้ววาง คอลัมน์การฟอกอากาศ ใน ซีท่อดูดส อีกครั้ง;

4) เติม 200 μL ของ บัฟเฟอร์ล้าง ไปที่ คอลัมน์การฟอกอากาศ,เครื่องเหวี่ยง 30-60 วินาที 13000 จี ทิ้งสารกรองแล้ววาง พีคอลัมน์ยูริฟิเคชั่นส ใน ซีท่อดูดส อีกครั้ง;

5) ทำซ้ำขั้นตอนที่ 4) หนึ่งครั้ง

6) โอนย้าย คอลัมน์การฟอกอากาศ เติม 10-30 μL ลงในหลอดเซนตริฟิวจ์ขนาด 1.5 มล. ที่เตรียมไว้ บัฟเฟอร์การชะล้าง สู่ใจกลางของแผ่นกรองหลังจากเปิดฝาและทำให้แห้งแล้ว และเก็บ ดีเอ็นเอ หลังจากยืนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 นาทีและปั่นเป็นเวลา 1 นาทีที่อุณหภูมิ 13000 จี-

7) จัดเก็บ ดีเอ็นเอ ชั่วคราวที่อุณหภูมิ -20 ℃ สำหรับการจัดเก็บในระยะยาว โปรดเก็บ ดีเอ็นเอ ที่อุณหภูมิ -80 ℃ และหลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ ที่ไม่จำเป็น

หมายเหตุ: ผลิตภัณฑ์จากการแปลงที่บริสุทธิ์สามารถนำไปใช้โดยตรงในปฏิกิริยา PCR หรือกระบวนการจัดลำดับขั้นถัดไปได้

คู่มือ