ชุดเตรียมร่วม DNA&RNA ของ Hieff NGS® วี2 เป็นชุดไลบรารีร่วม DNA&RNA สำหรับแพลตฟอร์มการจัดลำดับ Illumina®&MGI® ซึ่งประกอบด้วยรีเอเจนต์สังเคราะห์ cDNA ที่มีประสิทธิภาพและรีเอเจนต์ย่อยเอนไซม์ เมื่อเปรียบเทียบกับไลบรารีแบบเดิม การก่อสร้าง วิธีการนี้ผลิตภัณฑ์นี้สามารถทำการสังเคราะห์ cDNA และห้องสมุด DNA&RNA ได้อย่างมีประสิทธิภาพ การก่อสร้าง ในหลอดเดียว ชุดประกอบด้วยเอนไซม์คุณภาพสูงสำหรับการแตกตัวของ DNA และรวมการแตกตัวของ DNA การซ่อมแซมส่วนปลาย และการแยกส่วน dA เข้าเป็นขั้นตอนเดียว ซึ่งช่วยลดเวลาและต้นทุนในการจัดเตรียมห้องสมุดได้อย่างมาก ชุดเตรียมไลบรารีนี้มีอัตราการแปลงไลบรารีที่ยอดเยี่ยมและใช้ได้กับตัวอย่างจากสัตว์ พืช จุลินทรีย์ ฯลฯ ทั่วไปทั้งหมด รวมถึงตัวอย่าง FFPE ด้วย ชุดปรับปรุงนี้ใช้ลิเกสที่ปรับให้เหมาะสมล่าสุด ช่วยลดอัตราการผูกตัวเองในระหว่างการผูกอะแดปเตอร์ได้อย่างมาก นอกจากนี้ การนำโพลีเมอเรสที่มีความเที่ยงตรงสูงชนิดใหม่มาใช้ยังช่วยปรับปรุงความสม่ำเสมอและความเที่ยงตรงของการขยายสัญญาณอีกด้วย

ส่วนประกอบทั้งหมดที่ชุดจัดให้ได้ผ่านการควบคุมคุณภาพและการตรวจสอบการทำงานที่เข้มงวด ซึ่งช่วยให้มั่นใจในความเสถียรและความสามารถในการทำซ้ำของการสร้างไลบรารีได้มากที่สุด

ข้อมูลจำเพาะ

ส่วนประกอบ

บันทึก: * แสดงว่าน้ำยาตัวนี้ไม่รวมอยู่ในชุดนี้ และต้องมีน้ำยาเพิ่มเติมในชุด เป็น รองรับแพลตฟอร์มคู่ของ อิลลูมิน่า&เอ็มจีไอแต่ผสมไพรเมอร์เพิ่มเติม (CAT # 13334 ไพรเมอร์ผสมสำหรับ MGI และไพรเมอร์ผสม Cat# 13335 สำหรับ Illumina) เป็นสิ่งจำเป็น

ขั้นตอนการทำงาน:

พื้นที่จัดเก็บ

ควรเก็บผลิตภัณฑ์นี้ไว้ที่ -25~-15℃ เป็นเวลา 1 ปี.

หมายเหตุ

เกี่ยวกับการดำเนินการ

1. 1. โปรดปฏิบัติงานโดยสวมเสื้อคลุมแล็บและถุงมือแบบใช้แล้วทิ้ง เพื่อความปลอดภัยของคุณ
2. ละลายส่วนประกอบที่อุณหภูมิห้องหลังจากละลายแล้ว ให้ผสมให้เข้ากันโดยใช้เครื่องวอร์เท็กซ์ หมุนหลอดสั้นๆ แล้ววางลงบนน้ำแข็งเพื่อใช้ในภายหลัง
3. ขอแนะนำให้ทำปฏิกิริยาแต่ละขั้นตอนในเครื่อง Thermocycler ที่มีฝาปิดที่อุ่น ควรอุ่นเครื่อง Thermocycler ล่วงหน้าจนถึงอุณหภูมิที่ตั้งไว้ก่อนใช้งาน
4. กรุณาใช้วัสดุสิ้นเปลืองที่ไม่มี RNaseการปนเปื้อน และการทำความสะอาดพื้นที่ทดลอง RNAZap ของ ThermoFisher เป็นประจำ^{ทีเอ็ม} ขอแนะนำให้ใช้สเปรย์กำจัดกรดนิวคลีอิกที่มีประสิทธิภาพสูงเพื่อกำจัดการปนเปื้อน RNase
5. การดำเนินการที่ไม่เหมาะสมอาจทำให้เกิดการปนเปื้อนของละอองลอย ซึ่งส่งผลต่อความแม่นยำของผลลัพธ์แนะนำให้แยกบริเวณการผสมปฏิกิริยา PCR และบริเวณการทดสอบการทำให้บริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ PCR ออกจากกันทางกายภาพโดยบังคับ พร้อมทั้งติดตั้งอุปกรณ์ เช่น ปิเปตเฉพาะทางสำหรับการสร้างห้องสมุด
6. 6. ผลิตภัณฑ์นี้ใช้เพื่อการวิจัยเท่านั้น

อะแดปเตอร์ผูก

1. ชุด Illumina หรือ MGI Long Adapter (Barcoded Adapter) และชุด Short Adapter มีให้เลือกใช้ตามความต้องการในการทดลองของพวกเขา
2. ขอแนะนำให้เลือกใช้อะแดปเตอร์เชิงพาณิชย์ที่มีคุณภาพสูง หากเลือกอะแดปเตอร์ที่ผลิตเอง โปรดฝากบริษัทที่มีประสบการณ์ในการสังเคราะห์ไพรเมอร์ NGS และระบุถึงความจำเป็นในการควบคุมการปนเปื้อนอย่างเข้มงวด นอกจากนี้ ขอแนะนำให้เตรียมสารละลายแอนนีลลิ่ง DNA ในม้านั่งที่สะอาด และใช้อะแดปเตอร์เพียงชนิดเดียวในแต่ละครั้งเพื่อป้องกันการปนเปื้อนข้าม
3. โปรดละลายอะแดปเตอร์บนน้ำแข็งหรือที่อุณหภูมิ 4°C เมื่อใช้งานที่อุณหภูมิห้อง อุณหภูมิในห้องปฏิบัติการไม่ควรเกิน 25°C เพื่อป้องกันไม่ให้อะแดปเตอร์เสียสภาพ
4. ความเข้มข้นของอะแดปเตอร์ส่งผลโดยตรงต่อประสิทธิภาพการรัดและผลผลิตของคลังข้อมูล ปริมาตรของอะแดปเตอร์ที่เพิ่มเข้าไปในชุดอุปกรณ์จะถูกกำหนดไว้ที่ 5 μl ขอแนะนำให้เจือจางอะแดปเตอร์ด้วยบัฟเฟอร์ 0.1×TE และสามารถเก็บอะแดปเตอร์ที่เจือจางแล้วที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ตาราง1 แสดงรายการจำนวนอะแดปเตอร์ที่แนะนำสำหรับปริมาณ RNA อินพุตที่แตกต่างกัน

ตาราง 1-1 ผลิตภัณฑ์ Illumina ที่แนะนำ จำนวนอะแดปเตอร์สำหรับอินพุตที่แตกต่างกัน ดีเอ็นเอ&อาร์เอ็นเอ

ตาราง 1-2 MGI ที่แนะนำ จำนวนอะแดปเตอร์สำหรับอินพุตที่แตกต่างกัน ดีเอ็นเอ&อาร์เอ็นเอ

*การใช้งานอะแดปเตอร์สามารถปรับเปลี่ยนได้ตามประเภทของตัวอย่าง RNA ทั้งหมดและปริมาณอินพุตที่แตกต่างกัน

การขยายเสียงห้องสมุด

จำนวนรอบการขยายสัญญาณควรได้รับการควบคุมอย่างเคร่งครัด การขยายสัญญาณที่ไม่เพียงพออาจส่งผลให้ผลผลิตของไลบรารีต่ำ การขยายสัญญาณมากเกินไปอาจทำให้เกิดอคติ ข้อผิดพลาด การอ่านซ้ำ และผลิตภัณฑ์ไคเมอริกที่เพิ่มขึ้น ตาราง 2 แสดงรายการหมายเลขรอบที่แนะนำโดยตั้งเป้าผลผลิตของห้องสมุดที่ 1 μg

โต๊ะ 2 จำนวนรอบที่แนะนำในการสร้างไลบรารี DNA&RNA *

หมายเหตุ: *ผลผลิตของห้องสมุดไม่ได้ขึ้นอยู่กับปริมาณอินพุตและจำนวนรอบการขยายเท่านั้น แต่ยังขึ้นอยู่กับคุณภาพของตัวอย่าง เงื่อนไขการแยกส่วน และเงื่อนไขการเรียงลำดับด้วย ในกระบวนการสร้างห้องสมุด ให้เลือกเงื่อนไขที่เหมาะสมที่สุดตามสถานการณ์จริง

การทำความสะอาด DNA และการเลือกขนาดตามลูกปัด

1. 1. มีขั้นตอนหลายขั้นตอนในกระบวนการสร้างห้องสมุดที่ต้องใช้ลูกปัดแม่เหล็กสำหรับฟอก DNA เราขอแนะนำลูกปัดคัดเลือก DNA Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) หรือลูกปัดแม่เหล็ก AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) สำหรับการฟอก DNA และการเลือกขนาด
2. 2. ควรปรับสมดุลลูกปัดแม่เหล็กที่อุณหภูมิห้องก่อนใช้งาน มิฉะนั้น ผลผลิตจะลดลง และส่งผลต่อการเลือกขนาด
3. 3. ควรผสมลูกปัดแม่เหล็กให้เข้ากันโดยใช้วิธีวอร์เท็กซ์หรือปิเปตก่อนใช้งาน
4. 4. ห้ามดูดลูกปัดออกเมื่อถ่ายโอนของเหลวส่วนบน แม้ว่าจะมีลูกปัดเพียงเล็กน้อยก็อาจส่งผลต่อปฏิกิริยาต่อไปนี้ได้
5. 5. ควรเตรียมเอธานอล 80% ใหม่ๆ มิฉะนั้น จะส่งผลต่อประสิทธิภาพการกู้คืน
6. 6. ควรทำให้ลูกปัดแม่เหล็กแห้งที่อุณหภูมิห้องก่อนทำการชะผลิตภัณฑ์ออก หากผลิตภัณฑ์แห้งไม่เพียงพอ อาจทำให้เอธานอลที่เหลือส่งผลต่อปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นในภายหลังได้ หากแห้งมากเกินไป ลูกปัดแม่เหล็กจะแตกร้าวและลดปริมาณการฟอกให้บริสุทธิ์ โดยปกติแล้ว ควรทำให้ลูกปัดแห้งที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3-5 นาทีเพื่อให้แห้งสนิท
7. 7. หากจำเป็น ตัวอย่าง DNA ที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์หรือเลือกขนาดจะถูกชะออกมา1× สามารถเก็บบัฟเฟอร์ TE ที่อุณหภูมิ 4°C ได้นาน 1-2 สัปดาห์ หรือที่อุณหภูมิ -20°C ได้นาน 1 เดือน

การวิเคราะห์คุณภาพห้องสมุด

1. คุณภาพของห้องสมุดที่สร้างขึ้นโดยทั่วไปจะได้รับการวิเคราะห์โดยการวัดความเข้มข้นและการกระจายขนาด
2. สามารถวัดความเข้มข้นของห้องสมุดได้ด้วยวิธีที่ใช้สารเรืองแสง เช่น Qubit และ PicoGreen หรือ qPCR
3. ไม่แนะนำให้ใช้การวัดปริมาณตามการดูดกลืนแสง เช่น NanoDrop
4. ขอแนะนำให้ใช้วิธี qPCR สำหรับการวัดปริมาณไลบรารี: วิธีที่ใช้ฟลูออเรสเซนต์ เช่น Qubit และ PicoGreen ไม่สามารถแยกความแตกต่างระหว่างโครงสร้าง dsDNA ที่ไม่สมบูรณ์ (ส่วนที่แทรกโดยไม่มีอะแดปเตอร์หรือส่วนที่ปลายด้านใดด้านหนึ่งถูกผูกด้วยอะแดปเตอร์) จากไลบรารีที่สมบูรณ์ได้ วิธี qPCR จะขยายและวัดไลบรารีที่สมบูรณ์โดยที่ปลายทั้งสองข้างถูกผูกด้วยอะแดปเตอร์เท่านั้น (ไลบรารีที่เรียงลำดับได้) ซึ่งจะทำให้การวัดปริมาณโหลดมีความแม่นยำมากขึ้น
5. การกระจายขนาดของห้องสมุดสามารถวิเคราะห์ได้โดยใช้ Agilent Bioanalyzer หรืออุปกรณ์อื่นๆ ที่ใช้หลักการของอิเล็กโทรโฟรีซิสแบบเส้นเลือดฝอยหรือไมโครฟลูอิดิกส์

วัสดุอื่นๆ

1. 1.ลูกปัดแม่เหล็กทำความสะอาด DNA: ลูกปัดคัดเลือก DNA Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) หรือ AMPureXP Beads (A63880) หรือผลิตภัณฑ์เทียบเท่าอื่น ๆ

2.อะแดปเตอร์: อะแดปเตอร์ครบชุดสำหรับ Illumina (Yeasen หมายเลข Cat#13519-13520 หรือผลิตภัณฑ์เทียบเท่าอื่น ๆ หรืออะแดปเตอร์ครบชุดสำหรับ MGI (Yeasen Cat#13360-13362 หรือผลิตภัณฑ์เทียบเท่าอื่น ๆ)

3. การวิเคราะห์คุณภาพห้องสมุด: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip หรือผลิตภัณฑ์เทียบเท่าอื่น ๆ; สารเคมีเชิงปริมาณในห้องสมุด
4. วัสดุอื่นๆ: เอธานอลบริสุทธิ์ น้ำบริสุทธิ์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อ ปลายปิเปตที่มีการกักเก็บต่ำ หลอด PCR ขาตั้งแม่เหล็ก เครื่องปั่นความร้อน ฯลฯ

เอกสาร:

คู่มือการใช้งาน

12305ES-Hieff NGS® DNA&RNA Library Co-Prep Kit V2.pdf