ไฮฟ์ เอ็นจีเอส^{ทีเอ็ม} EvoMax RNA Library Prep Kit (dUTP) คือ ผสมไว้ล่วงหน้า แอกติโนไมซิน ดี ฟรีและ เฉพาะสาย ทั้งหมด ห้องสมุดจัดลำดับอาร์เอ็นเอ การเตรียมตัว ชุดอุปกรณ์ที่เข้ากันได้กับแพลตฟอร์ม Illumina และ MGI ผลิตภัณฑ์นี้มีให้เลือก 2 ประเภท: หลอด หรือชุดซีลและ ชุดนี้มีมากกว่า สะดวก ไม่ว่าจะเป็นอุปกรณ์จัดการของเหลวอัตโนมัติ หรือการจัดการด้วยมือ ชุดประกอบด้วยรีเอเจนต์การแยกส่วนของ RNA รีเอเจนต์การถอดรหัสย้อนกลับ รีเอเจนต์การสังเคราะห์ ds-cDNA เฉพาะสาย และรีเอเจนต์การขยายห้องสมุด สามารถเชื่อมโยงกับชุดทำความสะอาด mRNA หรือชุดกำจัด rRNA ได้ ทำการวิจัย mRNA หรือ lncRNA ผลิตภัณฑ์นี้เพิ่มประสิทธิภาพโมดูลการถอดรหัสย้อนกลับเพื่อให้ได้ไลบรารีที่มีความจำเพาะสูงโดยไม่ต้องใช้แอคติโนไมซินดี ซึ่งรับประกันความปลอดภัยของผู้ทดลองได้มากขึ้น รีเอเจนต์ทั้งหมดได้รับการควบคุมคุณภาพอย่างเข้มงวดและการตรวจสอบการทำงานเพื่อเพิ่มความเสถียรและความสามารถในการทำซ้ำของไลบรารีให้สูงสุด การตระเตรียม.

ข้อมูลจำเพาะ

ส่วนประกอบ

หมายเหตุ: * หมายเหตุระบุว่าส่วนประกอบไม่รวมอยู่ในชุด จำเป็นต้องใช้ส่วนผสมรองพื้นหากใช้อะแดปเตอร์ครบชุด มิฉะนั้นจะไม่สามารถใช้แทนได้-t. ชุดนี้เข้ากันได้กับแพลตฟอร์ม Illumina และ MGI แต่ต้องใช้ไพรเมอร์ผสมเพิ่มเติม (Cat # 13334 Primer Mix สำหรับ MGI^{ทีเอ็ม} และ Cat # 13335 Primer Mix สำหรับ Illumina®) สำหรับแพลตฟอร์ม Illumina® หรือ MGI หากใช้อะแดปเตอร์แบบครบชุด

รูป

การจัดวางของกลุ่มรีเอเจนต์แผ่น

รูปที่ 1: การจัดวางรีเอเจนต์ของชุดอุปกรณ์ห้องสมุดแผ่นปิดผนึก

รูปที่ 2 ส่วนประกอบโดยย่อของ ชุดเตรียมห้องสมุด RNA EvoMax

พื้นที่จัดเก็บ

ควรเก็บผลิตภัณฑ์นี้ไว้ที่ -25~-15℃ เป็นเวลา 1 ปี.

คำแนะนำ

1. ปริมาณที่แนะนำให้เติมในระบบ 20 μL คือ 0.1-1 หน่วย (U), และปริมาณอินพุตสามารถปรับได้ตามผลลัพธ์จริง

2. ตามความต้องการของการทดลอง ความเข้มข้นสุดท้ายของ dUTP สามารถปรับระหว่าง 0.2~0.6 mM และสามารถเพิ่ม dTTP 0.2 mM ได้แบบเลือกสรร

3. เวลาตอบสนองที่ 25~37℃ สามารถปรับได้ภายใน 5~10 นาที ตามความต้องการในการทดลอง

หมายเหตุ

1. การดำเนินการ

1) โปรดปฏิบัติงานโดยสวมเสื้อคลุมแล็บและถุงมือแบบใช้แล้วทิ้ง-เพื่อความปลอดภัยของคุณ-

2) ละลายส่วนผสมที่อุณหภูมิห้อง ผสมให้เข้ากันโดยพลิกขึ้นลงหลายๆ ครั้ง ปั่นให้ละเอียดสักครู่แล้ววางบนน้ำแข็งเพื่อใช้งาน

3) ขอแนะนำให้ทำปฏิกิริยาแต่ละขั้นตอนในเครื่องปั่นความร้อนที่มีฝาปิดที่อุ่นไว้ ควรอุ่นเครื่องปั่นความร้อนจนถึงอุณหภูมิที่ตั้งไว้ก่อนใช้งาน

4) จำเป็นต้องมีอุปกรณ์ที่ปราศจากการปนเปื้อนของ RNase และทำความสะอาดพื้นที่ทดลองเป็นประจำ RNAZap ของ ThermoFisher^{ทีเอ็ม} ขอแนะนำให้ใช้สเปรย์กำจัดกรดนิวคลีอิกที่มีประสิทธิภาพสูงเพื่อกำจัดการปนเปื้อน RNase

5) การดำเนินการที่ไม่เหมาะสมอาจทำให้เกิดการปนเปื้อนของละอองลอย ซึ่งส่งผลต่อความแม่นยำของผลลัพธ์ แนะนำให้แยกบริเวณการผสมปฏิกิริยา PCR และบริเวณการทดสอบการทำให้บริสุทธิ์ผลิตภัณฑ์ PCR ออกจากกันทางกายภาพ พร้อมอุปกรณ์ อาทิ หลอดปิเปตพิเศษ เพื่อการก่อสร้างห้องสมุด

6) สารเคมีนี้ใช้ได้ครั้งเดียวเท่านั้น ห้ามใช้ซ้ำหลายครั้งโดยเด็ดขาด

7) ผลิตภัณฑ์นี้ใช้เพื่อการวิจัยเท่านั้น

2. การเชื่อมต่ออะแดปเตอร์

1) ชุด Illumina หรือ MGI Long Adapter (Barcoded Adapter) และชุด Short Adapter มีให้เลือกใช้ตามความต้องการในการทดลองของพวกเขา

2) ขอแนะนำให้เลือกใช้อะแดปเตอร์เชิงพาณิชย์ที่มีคุณภาพสูง หากเลือกอะแดปเตอร์ที่ผลิตเอง โปรดฝากบริษัทที่มีประสบการณ์ในการสังเคราะห์ไพรเมอร์ NGS และระบุถึงความจำเป็นในการควบคุมการปนเปื้อนอย่างเข้มงวด นอกจากนี้ ขอแนะนำให้เตรียมสารละลายแอนนีลลิ่ง DNA ในม้านั่งที่สะอาด และใช้อะแดปเตอร์เพียงชนิดเดียวในแต่ละครั้งเพื่อป้องกันการปนเปื้อนข้าม

3) โปรดละลายอะแดปเตอร์บนน้ำแข็งหรือที่อุณหภูมิ 4°C เมื่อใช้งานที่อุณหภูมิห้อง อุณหภูมิในห้องปฏิบัติการไม่ควรเกิน 25°C เพื่อป้องกันไม่ให้อะแดปเตอร์เสียสภาพ

4) ความเข้มข้นของอะแดปเตอร์ส่งผลโดยตรงต่อประสิทธิภาพการผูกและผลผลิตของไลบรารี ปริมาตรของอะแดปเตอร์ที่เพิ่มเข้าไปในชุดจะคงที่ที่ 5 μl ขอแนะนำให้เจือจางอะแดปเตอร์ด้วยบัฟเฟอร์ 0.1×TE และอะแดปเตอร์ที่เจือจางสามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ตาราง 1 แสดงรายการจำนวนอะแดปเตอร์ที่แนะนำสำหรับปริมาณ RNA อินพุตที่แตกต่างกัน

ตาราง 1-1 ปริมาณอะแดปเตอร์ Illumina ที่แนะนำสำหรับ RNA อินพุตที่แตกต่างกัน

ตาราง 1-2 ปริมาณอะแดปเตอร์ MGI ที่แนะนำสำหรับ RNA อินพุตที่แตกต่างกัน

* การใช้งานอะแดปเตอร์สามารถปรับเปลี่ยนได้ตามประเภทของตัวอย่าง RNA ทั้งหมดและปริมาณอินพุตที่แตกต่างกัน

3.การขยายเสียงห้องสมุด

1) บนพื้นฐานของดีเอ็นเอโพลีเมอเรสรุ่นแรก ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสที่มีความเที่ยงตรงสูงในชุดอุปกรณ์ได้ปรับปรุงความสม่ำเสมอของการขยายสัญญาณให้ดีขึ้นอย่างมาก และไม่มีความลำเอียงในการขยายสัญญาณเลย

2) ควรควบคุมจำนวนรอบการขยายอย่างเคร่งครัด การขยายที่ไม่เพียงพออาจส่งผลให้ผลผลิตของไลบรารีต่ำ การขยายมากเกินไปอาจทำให้เกิดอคติที่เพิ่มขึ้น ข้อผิดพลาด การอ่านซ้ำ ผลิตภัณฑ์ไคเมอริก และการกลายพันธุ์แบบขยายที่สะสม ตารางที่ 2 แสดงจำนวนรอบที่แนะนำสำหรับการขยาย PCR

3) จำนวนรอบที่แนะนำในตาราง 2 สามารถตอบสนองข้อกำหนดในการเตรียมห้องสมุดได้เกือบทั้งหมด หากตัวอย่างของคุณมีคุณภาพต่ำ (เช่น ตัวอย่าง FFPE ที่มีการเสื่อมสภาพอย่างรุนแรง) จำนวนรอบอาจเพิ่มขึ้นได้ตามสถานการณ์จริง โปรดทราบว่า mRNA แตกต่างกันไปตามสปีชีส์และเนื้อเยื่อต่างๆ ดังนั้นควรปรับจำนวนรอบการขยาย

ตารางที่ 2 ปริมาตร RNA ทั้งหมดและรอบการขยายที่แนะนำ ตาราง *

[หมายเหตุ]: *ผลผลิตของห้องสมุดไม่ได้ขึ้นอยู่กับปริมาณอินพุตและจำนวนรอบการขยายเท่านั้น แต่ยังขึ้นอยู่กับคุณภาพของตัวอย่าง เงื่อนไขการแยกส่วน และเงื่อนไขการเรียงลำดับด้วย ในกระบวนการสร้างห้องสมุด ให้เลือกเงื่อนไขที่เหมาะสมที่สุดตามสถานการณ์จริง

4. การทำความสะอาด DNA และการเลือกขนาดตามลูกปัด

1) มีหลายขั้นตอนในกระบวนการสร้างห้องสมุดที่ต้องใช้ลูกปัดแม่เหล็กสำหรับฟอก DNA เราขอแนะนำลูกปัดคัดเลือก DNA Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) หรือลูกปัดแม่เหล็ก AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) สำหรับการฟอก DNA และการเลือกขนาด

2) ควรปรับสมดุลลูกปัดแม่เหล็กให้เท่ากับอุณหภูมิห้องก่อนใช้งาน มิฉะนั้น ผลผลิตจะลดลง และผลการเลือกขนาดจะได้รับผลกระทบ

3) ควรผสมลูกปัดแม่เหล็กให้เข้ากันโดยใช้วิธีวอร์เท็กซ์หรือปิเปตก่อนใช้งาน

4) ห้ามดูดลูกปัดออกเมื่อถ่ายโอนของเหลวส่วนบน แม้ว่าจะมีลูกปัดเพียงเล็กน้อยก็อาจส่งผลต่อปฏิกิริยาต่อไปนี้ได้

5) ควรเตรียมเอธานอล 80% ใหม่ๆ มิฉะนั้น จะส่งผลต่อประสิทธิภาพการกู้คืน

6) ควรทำให้ลูกปัดแม่เหล็กแห้งที่อุณหภูมิห้องก่อนทำการชะผลิตภัณฑ์ออก หากผลิตภัณฑ์แห้งไม่เพียงพอ อาจทำให้เอธานอลที่เหลือส่งผลต่อปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นในภายหลังได้ง่าย หากแห้งมากเกินไป ลูกปัดแม่เหล็กจะแตกร้าวและลดปริมาณการฟอกให้บริสุทธิ์ โดยปกติแล้ว ควรทำให้ลูกปัดแห้งที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3-5 นาทีก็เพียงพอที่จะทำให้ลูกปัดแห้งสนิท

7) หากจำเป็น ตัวอย่าง DNA ที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์หรือเลือกขนาดแล้วซึ่งแยกออกจากบัฟเฟอร์ TE สามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 1-2 สัปดาห์หรือที่อุณหภูมิ -20°C เป็นเวลาหนึ่งเดือน

5.การวิเคราะห์คุณภาพห้องสมุด

โดยทั่วไปคุณภาพของห้องสมุดที่สร้างขึ้นสามารถประเมินได้โดยการตรวจจับความเข้มข้นและการตรวจจับการกระจายความยาว

6. วัสดุอื่นๆ

1) ชุดเสริมสมรรถนะ mRNA: Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen หมายเลขแมว # 12629).

2) ชุดกำจัด rRNA: ชุดกำจัด rRNA ของมนุษย์ Hieff NGS® MaxUp (rRNA & ITS / ETS) (Yeasen หมายเลขแมว # 12257) หรือชุดถอด rRNA อื่นๆ

3) การทำให้บริสุทธิ์ RNA ของลูกปัดแม่เหล็ก: Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen หมายเลขหมวดหมู่ # 12602) หรือผลิตภัณฑ์เทียบเท่าอื่น ๆ

4) ลูกปัดแม่เหล็กที่บริสุทธิ์ด้วย DNA: ลูกปัด Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen หมายเลขหมวดหมู่ # 12601) หรือ AMPure® XP Beads (A63880) หรือผลิตภัณฑ์เทียบเท่าอื่น ๆ

5) การควบคุมคุณภาพ RNA: Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico Chip หรือผลิตภัณฑ์เทียบเท่าอื่น ๆ

6) อะแดปเตอร์: อะแดปเตอร์แบบครบชุดสำหรับการใช้งาน Illumina® (หมายเลขหมวดหมู่ 13519-13520 หรือเทียบเท่าอื่น ๆ) หรืออะแดปเตอร์แบบครบชุดสำหรับการใช้งาน MGI® (หมายเลขหมวดหมู่ 13360-13362 หรือเทียบเท่าอื่น ๆ)

7. การตรวจสอบคุณภาพห้องสมุด

ชิป Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 / ชิปความไวสูงหรือผลิตภัณฑ์เทียบเท่าอื่น ๆ สารเคมีวัดปริมาณในห้องสมุด

8. วัสดุอื่นๆ

เอธานอลไร้น้ำ น้ำบริสุทธิ์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อ หัวปืนดูดซับต่ำ หลอด PCR โครงแม่เหล็ก เครื่องมือ PCR ฯลฯ

แผนภูมิการไหล

รูปที่ 1: กระบวนการสร้างห้องสมุด RNA

การเตรียมไลบรารี RNA สำหรับตัวอย่าง FFPE คุณภาพที่แตกต่างกัน

สำหรับ FFPE RNA ที่ย่อยสลายอย่างรุนแรง (DV 200 <50%) และตัวอย่างอินพุตต่ำ เราขอแนะนำโปรโตคอลการทำให้บริสุทธิ์สองครั้งหลังจากการผูกอะแดปเตอร์เพื่อลดการสูญเสียไลบรารี

รูปแบบจุดสูงสุดของตัวอย่าง FFPE คุณภาพที่แตกต่างกัน