การขยายแบบไม่จำเพาะของ Taq DNA polymerase เป็นปัญหาทั่วไปในการทดลอง PCR ซึ่งส่งผลโดยตรงต่อการตีความผลการตรวจจับ และอาจทำให้ความไวในการขยายลดลง และแม้แต่ผลผลิตของชิ้นส่วนเป้าหมายลดลง การใช้เอนไซม์ดัดแปลงเพื่อปิดผนึกศูนย์กลางที่ใช้งานของ Taq DNA polymerase ที่อุณหภูมิห้อง จึงยับยั้งกิจกรรมของ DNA polymerase ของเอนไซม์ Taq ที่อุณหภูมิห้อง ถือเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพสูงสุดในปัจจุบันในการยับยั้งการขยายแบบไม่จำเพาะ แอนติบอดีปิดผนึกสองทางที่พัฒนาโดย Yisheng ไม่เพียงแต่ปิดผนึกกิจกรรมของโพลีเมอเรสของ Taq DNA polymerase เท่านั้น แต่ยังปิดผนึกกิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอสของ Taq DNA polymerase ในเวลาเดียวกันอีกด้วย วิธีการแบบสองทางนี้มีประสิทธิภาพในการป้องกันการขยายแบบไม่จำเพาะที่เกิดจากการจับคู่ผิดหรือไพรเมอร์ไดเมอร์ และยังป้องกันการสร้างสัญญาณแบบไม่จำเพาะอันเนื่องมาจากการเสื่อมสภาพของวัสดุ จึงเพิ่มความจำเพาะของรีเอเจนต์เป็นสองเท่า ทำให้รีเอเจนต์ในการตรวจจับสามารถรับมือกับการขนส่งหรือการใช้งานที่อุณหภูมิห้องได้อย่างง่ายดาย

1.ความจำเพาะในการขยายสัญญาณที่สูงมาก—แอนติบอดีที่ปิดผนึกสองชั้นสามารถปิดผนึกกิจกรรมของพอลิเมอเรสและเอ็กโซนิวคลีเอสได้พร้อมกัน ช่วยหลีกเลี่ยงการขยายสัญญาณที่ไม่จำเพาะและเพิ่มความจำเพาะได้อย่างมีประสิทธิภาพ

2.ความไวในการตรวจจับที่เหนือชั้น—สูตรการเริ่มต้นแบบฮอตช่วยให้ตรวจจับยีนที่มีปริมาณน้อยได้อย่างมีประสิทธิภาพ จึงให้ความไวที่สูงขึ้น

3.ความเสถียรของผลิตภัณฑ์ที่โดดเด่น — มีเสถียรภาพในการทำงานเมื่อวางไว้ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 5 วันหรือที่ 4°C เป็นเวลา 10 วัน

4.เสถียรภาพของฐานอ้างอิงและความเป็นเส้นตรงที่ดี—การแก้ไขปัญหาของการดริฟท์ของฐานอ้างอิง ส่งผลให้ได้ความเป็นเส้นตรงที่ยอดเยี่ยม

5.การปล่อยกิจกรรมเอนไซม์อย่างรวดเร็ว - กิจกรรมเอนไซม์มากกว่า 95% สามารถปล่อยออกมาได้โดยการให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 20 วินาที

6.ความสามารถในการนำไปใช้ได้หลากหลายของเอนไซม์—เหมาะสำหรับเอนไซม์ Taq ทั้งชนิดป่าและชนิดกลายพันธุ์ โดยแอนติบอดี 1 มก. สามารถปิดผนึกเอนไซม์ Taq ได้ 4-10 KU

1 การปิดกั้นกิจกรรมของเอนไซม์ Taq DNA polymerase exonuclease

โพรบไพรเมอร์สังเคราะห์ถูกผสมลงในส่วนผสมปฏิกิริยาของ Taq DNA polymerase ตามลำดับ โดยที่ไม่ได้ปิดผนึกหรือปิดผนึกด้วยแอนติบอดีแบบปิดสองชั้น และปฏิกิริยาเกิดขึ้นที่อุณหภูมิ 40°C ตรวจพบสัญญาณฟลูออเรสเซนซ์ของทั้งสองแบบ และพบว่าแอนติบอดีแบบปิดสองชั้นสามารถปิดผนึกกิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอสของ Taq DNA polymerase ได้อย่างมีประสิทธิภาพ

รูปที่ 2 การตรวจจับประสิทธิภาพการปิดผนึกของกิจกรรมแอนติบอดี-เอนโดนิวคลีเอสที่ปิดผนึกสองชั้น

02 การตรวจสอบความไวในการตรวจจับ

โดยใช้ตามลำดับ Yeasenแอนติบอดีปิดผนึกสองชั้นของบริษัท T และแอนติบอดีของบริษัท T เพื่อปิดผนึกเอนไซม์ Taq ตามด้วยการตรวจจับตัวอย่างเชิงบวกผ่านเทคโนโลยี ARMS-PCR พบว่าเอนไซม์ Taq ปิดผนึกโดย Yeasenแอนติบอดีที่ปิดผนึกสองชั้นมีความแม่นยำในการขยาย ARMS-PCR ด้วยความไวที่สูงขึ้น

สีแดง:Yeasen แอนติบอดี+แทค- สีฟ้า: ซัพพลายเออร์ A แอนติบอดี + Taq-

รูปที่ 3 กราฟขยายของ ARMS-PCR

03 การตรวจสอบความเสถียร (4°C เป็นเวลา 10 วัน, 37°C เป็นเวลา 5 วัน)

การใช้แอนติบอดีแบบปิดแบบดั้งเดิมและแอนติบอดีแบบปิดสองชั้นเพื่อบล็อกโพลีเมอเรสดีเอ็นเอ Taq ตามลำดับ โพลีเมอเรสจะถูกกำหนดสูตรเป็นสารละลายพรีมิกซ์ที่สมบูรณ์ซึ่งประกอบด้วยไพรเมอร์และโพรบ สารละลายนี้จะถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 10 วันหรือที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 1, 3 และ 5 วัน จากนั้นจึงนำไปใช้ขยายพลาสมิด ASF จำนวน 10,000 ชุด พบว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในเส้นโค้งการขยายและค่า Ct

รูปที่ 4 กราฟขยายพลาสมิด ASF จำนวน 10,000 ชุด หลังจากโพลีเมอเรส Taq ถูกบล็อกด้วยแอนติบอดีบล็อกแบบดั้งเดิม (A) และแอนติบอดีบล็อกคู่ (B) ขยายด้วยระบบ qPCR-

04 การตรวจจับเส้นฐาน

ในเงื่อนไขบางประการที่ใช้ไพรเมอร์เฉพาะร่วมกับบัฟเฟอร์และเครื่องมือเฉพาะ อาจเกิดปรากฏการณ์ที่เรียกว่าการเลื่อนระดับเบสไลน์ได้ อย่างไรก็ตาม การใช้แอนติบอดีแบบปิดสองชั้นสามารถแก้ไขปัญหาการเลื่อนระดับเบสไลน์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ จึงทำให้เบสไลน์มีเสถียรภาพมากขึ้น

รูปที่ 5 กราฟขยายของยีน N ของ SARS-CoV-2 (A) และยีน ACT (B) ในการวิเคราะห์ qPCR

05 การตรวจสอบความเป็นเส้นตรง

ส่วนผสมปฏิกิริยาที่ปิดผนึกด้วยแอนติบอดีแบบปิดสองชั้นถูกนำมาใช้เพื่อขยายพลาสมิดคู่ ASFV/ACT จำนวน 100,000, 10,000, 1,000 และ 100 ชุดเพื่อสร้างกราฟมาตรฐาน ดังที่เห็นได้จากรูปที่ 7 ทั้งสองแบบแสดงให้เห็นถึงความเป็นเส้นตรงที่ดี

รูปที่ 6 กราฟเส้นโค้งมาตรฐานสำหรับยีน ASFV และยีน ACT ที่สร้างขึ้นโดยใช้ส่วนผสมปฏิกิริยาแบบบล็อกคู่

06 การทดสอบการปลดปล่อยกิจกรรมเอนไซม์

โดยใช้แอนติบอดีแบบปิดสองชั้น (Cat#31303) จาก Yeasen เพื่อปิดผนึกเอนไซม์ Taq และให้ผ่านความร้อนที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 20 วินาที จึงตรวจพบกิจกรรมของเอนไซม์ สามารถสังเกตได้ว่าหลังจากผ่านความร้อนที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 20 วินาที 31303 สามารถปลดปล่อยกิจกรรมของเอนไซม์ได้มากกว่า 95% ซึ่งเทียบได้กับแอนติบอดีจากบริษัท T

ตารางที่ 1 การให้ความร้อนเอนไซม์ที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 20 วินาที

07 การตรวจจับโพลิเมอเรสแบบมัลติเพล็กซ์ Taq

Yeasenแอนติบอดีปิดสองชั้นของ Taq (Cat#31303) ถูกใช้เพื่อปิดผนึกโพลีเมอเรส Taq สามประเภท (ประเภทป่า + ประเภทกลายพันธุ์สองประเภท) ด้วยอัตราส่วนการปิดผนึก 1μg ต่อ 5U และวัดค่าฟลูออเรสเซนซ์และประสิทธิภาพการปิดผนึก พบว่าสำหรับโพลีเมอเรส Taq ประเภทต่างๆ Yeasenแอนติบอดีที่ปิดสองชั้นของ (Cat#31303) แสดงให้เห็นผลปิดผนึกที่ดี

ตารางที่ 2 ประสิทธิภาพการบล็อกของโพลีเมอเรส Taq ชนิดต่างๆ