ชุดตรวจหาภาวะอะพอพโทซิสของเซลล์ Annexin V-EGFP/PI ใช้ Annexin V ที่มีฉลาก EGFP เป็นโพรบเพื่อตรวจจับการเกิดภาวะอะพอพโทซิสของเซลล์ในระยะเริ่มต้น
หลักการตรวจจับมีดังนี้: ในเซลล์ที่มีชีวิตปกติ ฟอสโฟไทดิลเซอรีน (PS) จะอยู่ที่ด้านในของเยื่อหุ้มเซลล์ แต่ในเซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสในระยะเริ่มต้น PS จะพลิกจากด้านในของเยื่อหุ้มเซลล์ไปที่พื้นผิวของเยื่อหุ้มเซลล์และสัมผัสกับสภาพแวดล้อมภายนอกเซลล์ Annexin-V เป็น Ca²⁺ โปรตีนที่จับกับฟอสโฟลิปิดที่มีน้ำหนักโมเลกุล 35 ถึง 36 kDa ที่จับกับ PS ด้วยความสัมพันธ์สูง ฟอสฟาติดิลเซอรีนสามารถจับกับเยื่อหุ้มเซลล์อะพอพโทซิสในระยะเริ่มต้นได้ผ่านฟอสฟาติดิลเซอรีนที่เปิดเผยออกมาที่ด้านนอกของเซลล์
นอกจากนี้ โพรพิดิอุมไอโอไดด์ (PI) ยังใช้เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างเซลล์ระยะเริ่มต้นที่รอดชีวิตกับเซลล์ที่ตายหรือเซลล์อะพอพโทซิสในระยะหลัง PI เป็นสีย้อมกรดนิวคลีอิกซึ่งไม่สามารถผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ที่สมบูรณ์ของเซลล์ปกติหรือเซลล์อะพอพโทซิสในระยะเริ่มต้นได้ แต่สามารถผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ของเซลล์ที่ตายในระยะหลังและเซลล์ที่ตายได้ และทำให้มีนิวเคลียสเป็นสีแดง ดังนั้น เมื่อ Annexin V ผสมกับ PI PI จึงถูกแยกออกจากเซลล์ที่มีชีวิต (Annexin V^-/พีไอ^-) และเซลล์อะพอพโทซิสระยะเริ่มต้น (Annexin V^-/พีไอ^-) เซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสและเซลล์เนื้อตายในระยะท้ายจะมีค่าบวกสองเท่าสำหรับทั้ง EGFP และ PI (Annexin V^-/พีไอ^--
ชุดนี้เหมาะสำหรับการไหลเวียนไซโตเมทรีและกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง

ส่วนประกอบของผลิตภัณฑ์

การขนส่งและการเก็บรักษา

ส่วนประกอบต่างๆ จะถูกจัดส่งพร้อมกับถุงน้ำแข็งและสามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°C หลีกเลี่ยงแสง และหลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ เป็นเวลา 1 ปี
[หมายเหตุ]: หากจำเป็นต้องใช้ซ้ำในช่วงเวลาสั้นๆ สามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4℃ และป้องกันไม่ให้ถูกแสงได้นานครึ่งปี

ข้อควรระวัง

1) เนื่องจากอะพอพโทซิสเป็นกระบวนการที่รวดเร็ว จึงขอแนะนำให้วิเคราะห์ตัวอย่างภายใน 1 ชั่วโมงหลังการย้อมสี
2) สำหรับเซลล์ที่มีการยึดเกาะ การย่อยเป็นขั้นตอนที่สำคัญ อย่าใช้ EDTA ในสารละลายย่อยอาหาร เนื่องจาก EDTA อาจส่งผลต่อการจับกันของ Annexin V กับ PS
3) ควรใช้ Annexin V-FITC แต่ไม่ใช่ Annexin V-EGFP เพื่อตรึงเซลล์ เช่น เพื่อตรวจจับอะพอพโทซิสและวงจรเซลล์ในเวลาเดียวกัน เนื่องจาก EGFP จะถูกเปลี่ยนสภาพและสูญเสียความสามารถในการกระตุ้นการเรืองแสงในระหว่างการตรึง เซลล์ได้รับการฟักด้วย Annexin V-FITC ก่อนการตรึง และ Annexin V-FITC ที่ไม่ถูกผูกมัดจะถูกชะล้างออกไปด้วย Binding Bufferเนื่องจากความสามารถในการซึมผ่านของเซลล์ที่เพิ่มขึ้นในระหว่างการตรึงทำให้เกิดเศษเซลล์ที่สามารถจับกับ Annexin V และรบกวนผลลัพธ์ได้
4) หากตัวอย่างมาจากเลือด ให้นำเกล็ดเลือดออกจากเลือด เนื่องจากเกล็ดเลือดมีสาร PS ซึ่งสามารถจับกับสาร Annexin V ได้ ซึ่งอาจส่งผลต่อผลการตรวจ สามารถล้างเกล็ดเลือดออกได้โดยใช้สารบัฟเฟอร์ที่มี EDTA และปั่นเหวี่ยงที่ 200 g
5) โปรดปั่นสารเคมีเป็นเวลาสั้นๆ ก่อนเปิดฝา และโยนของเหลวบนผนังด้านในของฝาไปที่ก้นหลอดเพื่อหลีกเลี่ยงการโรยของเหลวเมื่อเปิดฝา
6) แอนเน็กซิน V-EGFP และ PI เป็นสารที่ไวต่อแสง ดังนั้นโปรดหลีกเลี่ยงการสัมผัสแสงในระหว่างการทำงาน
7) เพื่อการวิจัยเท่านั้น!

คำแนะนำ

การออกแบบการทดลอง
หลอดเปล่า: เซลล์ควบคุมเชิงลบที่ไม่มี Annexin V-EGFP และสารละลายการย้อม PI ถูกนำมาใช้เพื่อการควบคุมแรงดันไฟฟ้า
หลอดที่ย้อมเดี่ยว: เซลล์ควบคุมเชิงบวกที่เสริมด้วย Annexin V-EGFP เท่านั้น ถูกนำมาใช้เพื่อปรับค่าชดเชย
การตรวจจับหลอด: เซลล์ได้รับการบำบัดด้วย Annexin V-EGFP และ PI Staining Solution ข้อมูลการทดลองได้รับโดยการปรับพารามิเตอร์ของหลอดเปล่าและหลอดย้อมสีเดี่ยว
1.1 การย้อมสีตัวอย่าง
1) เซลล์แขวนลอย: รวบรวมเซลล์โดยการปั่นที่ 300 g เป็นเวลา 5 นาที ที่ 4 °C
เซลล์ที่ยึดเกาะ: หลังจากย่อยด้วยทริปซินโดยไม่ใช้ EDTA แล้ว เซลล์จะถูกเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 300 กรัมเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เวลาในการย่อยด้วยทริปซินไม่ควรนานเกินไปเพื่อป้องกันผลบวกปลอม
2) ล้างเซลล์ด้วย PBS ที่ทำความเย็นล่วงหน้าสองครั้ง แต่ละครั้งใช้ปริมาณ 300 g และปั่นที่อุณหภูมิ 4 ℃ เป็นเวลา 5 นาที
3) เซลล์ถูกทำให้แขวนลอยใหม่ด้วยบัฟเฟอร์การจับ 1× และปรับความเข้มข้นเป็น 1~5 ×106/mL
4) เติมเซลล์แขวนลอย 100 μL ลงในหลอดไซโตเมทรีไหลขนาด 5 มล. เติม Annexin V-EGFP ขนาด 5 μl ลงไป จากนั้นผสมเซลล์และฟักที่อุณหภูมิห้องภายใต้แสงเป็นเวลา 5 นาที
5) การย้อมจะดำเนินไปทันทีโดยเติมสารละลาย PI 10 μl และ PBS 400 μl
[หมายเหตุ]: เมื่อใช้การไหลเวียนไซโตเมทรีเพื่อตรวจหาอะพอพโทซิส PI จะได้รับผลกระทบเป็นอย่างมากจากเวลา และหากใช้เวลานานเกินไปจะส่งผลให้การย้อม PI เพิ่มขึ้น ดังนั้นควรทำการไหลเวียนไซโตเมทรีให้เสร็จภายใน 1 ชั่วโมง
1.2 การวิเคราะห์การไหลเวียนไซโตเมทรี
ความยาวคลื่นกระตุ้นสูงสุดของ EGFP คือ 488 นาโนเมตร และความยาวคลื่นการปล่อยสูงสุดคือ 507 นาโนเมตร ความยาวคลื่นกระตุ้นสูงสุดของคอมเพล็กซ์ PI-DNA คือ 535 นาโนเมตร และความยาวคลื่นการปล่อยสูงสุดคือ 615 นาโนเมตร ซอฟต์แวร์เช่น CellQuest ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์และวาดกราฟจุดสองสี โดย EGFP คือแกน x และ PI คือแกน x รวบรวมเหตุการณ์ 10,000 รายการต่อตัวอย่าง ในการทดลองทั่วไป เซลล์สามารถแบ่งออกเป็นสามกลุ่มย่อย เซลล์ที่มีชีวิตมีฟลูออเรสเซนต์พื้นหลังที่มีความเข้มต่ำมาก เซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสในระยะแรกมีฟลูออเรสเซนต์สีเขียวที่เข้มข้นเท่านั้น และเซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสในระยะหลังมีการย้อมฟลูออเรสเซนต์สีเขียวและสีแดงแบบสองสี