หลักการตรวจจับของชุดตรวจจับอะพอพโทซิส Annexin V-Alexa Fluor488/PI มีดังนี้: ในเซลล์ที่มีชีวิตปกติ ฟอสโฟติดิลเซอรีน (PS) จะอยู่ที่ด้านในของเยื่อหุ้มเซลล์ แต่ในเซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสในระยะเริ่มต้น PS จะพลิกจากด้านในของเยื่อหุ้มเซลล์ไปที่พื้นผิวของเยื่อหุ้มเซลล์และสัมผัสกับสภาพแวดล้อมภายนอกเซลล์ Annexin-V เป็น Ca²⁺ โปรตีนที่จับกับฟอสโฟลิปิดที่มีน้ำหนักโมเลกุล 35 ถึง 36KD ซึ่งจะจับกับ PS ด้วยความสัมพันธ์สูง และจับกับเยื่อหุ้มเซลล์ของเซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสในระยะเริ่มต้นผ่านฟอสฟาติดิลเซอรีนที่เปิดเผยอยู่ภายนอกเซลล์
นอกจากนี้ โพรพิดิอุมไอโอไดด์ (PI) ยังใช้เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างเซลล์ระยะเริ่มต้นที่รอดชีวิตกับเซลล์ที่ตายหรือเซลล์อะพอพโทซิสในระยะหลัง PI เป็นสีย้อมกรดนิวคลีอิกซึ่งไม่สามารถผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ที่สมบูรณ์ของเซลล์ปกติหรือเซลล์อะพอพโทซิสในระยะเริ่มต้นได้ แต่สามารถผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ของเซลล์ที่ตายในระยะหลังและเซลล์ที่ตายได้ และทำให้มีนิวเคลียสเป็นสีแดง ดังนั้น เมื่อ Annexin V ผสมกับ PI PI จึงถูกแยกออกจากเซลล์ที่มีชีวิต (Annexin V^-/พีไอ^-) และเซลล์อะพอพโทซิสระยะเริ่มต้น (Annexin V^-/พีไอ^-) ในทางตรงกันข้าม เซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสในระยะปลายและเซลล์เนื้อตายกลับมีผลลัพธ์เป็นบวกสองเท่าสำหรับ Alexa Fluor488 และ PI (Annexin V^-/พีไอ^--

ส่วนประกอบของผลิตภัณฑ์

การขนส่งและการเก็บรักษา

ส่วนประกอบจะถูกจัดส่งพร้อมกับถุงน้ำแข็งและสามารถจัดเก็บที่อุณหภูมิ -20°C ได้นานถึง 1 ปี

ข้อควรระวัง

1) เนื่องจากอะพอพโทซิสเป็นกระบวนการที่รวดเร็ว จึงขอแนะนำให้วิเคราะห์ตัวอย่างภายใน 1 ชั่วโมงหลังการย้อมสี
2) สำหรับเซลล์ที่มีการยึดเกาะ การย่อยเป็นขั้นตอนที่สำคัญ อย่าใช้ EDTA ในสารละลายย่อยอาหาร เนื่องจาก EDTA อาจส่งผลต่อการจับกันของ Annexin V กับ PS
3) หากตัวอย่างมาจากเลือด ให้นำเกล็ดเลือดออกจากเลือด เนื่องจากเกล็ดเลือดมีสาร PS ซึ่งสามารถจับกับสาร Annexin V ได้ ซึ่งอาจส่งผลต่อผลการตรวจได้ จึงสามารถใช้สารบัฟเฟอร์ที่มี EDTA และล้างเกล็ดเลือดออกด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 200 g
4) โปรดปั่นสารเคมีสักครู่ก่อนเปิดฝา และโยนของเหลวบนผนังด้านในของฝาไปที่ก้นหลอดเพื่อหลีกเลี่ยงการโรยของเหลวเมื่อเปิดฝา
5) Annexin V-Alexa Fluor488 และ PI เป็นสารที่ไวต่อแสงและควรเก็บให้ห่างจากแสงขณะใช้งาน
6) เพื่อการวิจัยเท่านั้น!

คำแนะนำ

1.1 ตัวอย่างการย้อมสี
1.ก) เซลล์แขวนลอย: รวบรวมเซลล์โดยการปั่นที่ 300 g เป็นเวลา 5 นาที ที่ 4°C
ข) เซลล์ที่ยึดเกาะ: หลังจากย่อยด้วยทริปซินโดยไม่ใช้ EDTA แล้ว เซลล์จะถูกเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 300 g เป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 °C เวลาในการย่อยด้วยทริปซินไม่ควรนานเกินไปเพื่อป้องกันผลบวกปลอม
2. ล้างเซลล์ด้วย PBS สองครั้งโดยทำความเย็นไว้ที่ 4 °C ในแต่ละครั้งใช้ 300g และปั่นที่อุณหภูมิ 4 °C เป็นเวลา 5 นาที
3. เซลล์ถูกทำให้แขวนลอยใหม่โดยการเติม 250 μL 1×Binding Buffer และปรับความเข้มข้นเป็น 1×106/mL
4. เติมเซลล์แขวนลอย 100 μL ลงในหลอดไซโตเมทรีไหลขนาด 5 มล. เติม Annexin V-Alexa Fluor 488 ขนาด 5 μL และ PI ขนาด 10 μL แล้วผสมเบาๆ
5. เก็บปฏิกิริยาไว้ให้ห่างจากแสงและเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที
6. เติมบัฟเฟอร์ 1×Binding ปริมาณ 400 μL ผสมให้เข้ากัน และตรวจหาตัวอย่างด้วยการไหลเวียนไซโตเมทรีภายใน 1 ชั่วโมง
[หมายเหตุ]: เพื่อหลีกเลี่ยงการสูญเสียเซลล์ในระหว่างการล้างเซลล์ สามารถใช้ปลายเล็กๆ เพื่อดูดของเหลวออก
1.2 การวิเคราะห์การไหลเวียนไซโตเมทรี
Alexa Fluor488 มีความยาวคลื่นเร้าสูงสุด 488 นาโนเมตรและมีความยาวคลื่นการแผ่รังสีสูงสุด 519 นาโนเมตร ความยาวคลื่นเร้าสูงสุดของคอมเพล็กซ์ PI-DNA คือ 535 นาโนเมตรและมีความยาวคลื่นการแผ่รังสีสูงสุดคือ 615 นาโนเมตร CellQuest และซอฟต์แวร์อื่น ๆ ถูกนำมาใช้เพื่อวิเคราะห์และวาดกราฟจุดสองสีโดยใช้ Alexa Fluor488 เป็นแกน x และแกน PI เป็นแกน ordinate รวบรวมเหตุการณ์ 10,000 รายการต่อตัวอย่าง
1.3 การวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์
1) หยดเซลล์ที่ถูกแขวนลอยที่ย้อม Annexin V-FITC/PI สองครั้งลงบนสไลด์ แล้วปิดเซลล์ด้วยแผ่นปิด
2) สังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ที่มีฟิลเตอร์สองสี สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ของ Annexin V-FITC เป็นสีเขียว และสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ของ PI เป็นสีแดง