เมื่อเซลล์เข้าสู่ภาวะอะพอพโทซิส เซลล์จะกระตุ้นเอนไซม์เอนโดนิวคลีเอสที่ตัดดีเอ็นเอจีโนมระหว่างนิวคลีโอโซม บันไดดีเอ็นเอขนาด 180-200bp ตรวจพบโดยอิเล็กโทรโฟรีซิสหลังการสกัดดีเอ็นเอระหว่างภาวะอะพอพโทซิส
ชุดตรวจจับอะพอพโทซิส TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) (Alexa Fluor 488) สามารถใช้ตรวจจับการแตกตัวของดีเอ็นเอในนิวเคลียสในกระบวนการอะพอพโทซิสตอนปลายของเซลล์เนื้อเยื่อ หลักการคือภายใต้การทำงานของเทอร์มินัลดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทดิลทรานสเฟอเรส (TdT) Alexa Fluor 488-12-DUTP จะถูกผสมเข้ากับเทอร์มินัล 3´ -ไฮดรอกซิล (3´-OH) ที่ถูกเปิดเผยระหว่างการแตกตัวของดีเอ็นเอของจีโนม ดังนั้นจึงสามารถตรวจจับได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์หรือการไหลเวียนไซโตเมทรี
สีย้อม Alexa Fluor 488 มีความเสถียรมากกว่าและมีสัญญาณที่แรงกว่า ส่งผลให้เครื่องหมายสว่างขึ้นและมีความต้านทานต่อการดับที่มากขึ้น
ชุดทดสอบนี้มีขอบเขตการใช้งานที่กว้างขวางและสามารถใช้ตรวจจับอะพอพโทซิสในส่วนที่แช่แข็งหรือพาราฟิน รวมถึงในเซลล์ที่ยึดเกาะหรือแขวนลอยที่เพาะเลี้ยงไว้

ส่วนประกอบของผลิตภัณฑ์

การขนส่งและการเก็บรักษา

ส่วนประกอบต่างๆ จะถูกจัดส่งพร้อมกับถุงน้ำแข็งและสามารถจัดเก็บได้ที่อุณหภูมิ -20°C เป็นเวลา 1 ปี.

ข้อควรระวัง

1. จำเป็นต้องเตรียม PBS ของตัวเองเพื่อล้างเซลล์ สารละลายดับการเรืองแสงเพื่อปิดผนึกเม็ดยา และพาราฟอร์มาลดีไฮด์ 4% เพื่อการตรึง

2. เพื่อการวิจัยเท่านั้น!

คำแนะนำ

1. การเตรียมตัวอย่าง
1.1 การตัดเนื้อเยื่อฝังพาราฟิน
1.1.1. จุ่มส่วนเนื้อเยื่อพาราฟินในไซลีนเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องและทำซ้ำอีกครั้งเพื่อขจัดพาราฟินออกให้หมด
1.1.2.แช่ชิ้นส่วนต่างๆ ในเอธานอล 100% เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง แล้วทำซ้ำอีกครั้ง
1.1.3. ที่อุณหภูมิห้อง ให้แช่ตัวอย่างในเอธานอลแบบไล่ระดับ (90, 80, 70%) ครั้งละ 3 นาที
1.1.4. ล้างส่วนต่างๆ ด้วย PBS อย่างเบามือ และซับของเหลวส่วนเกินรอบๆ ตัวอย่างบนสไลด์แก้วอย่างระมัดระวังด้วยกระดาษกรอง ในกรณีนี้ สามารถใช้ปากกาพาราฟินหรือปากกาไฮโดรโฟบิกเพื่อวาดโครงร่างของการกระจายตัวอย่างรอบๆ ตัวอย่าง ซึ่งสะดวกสำหรับการประมวลผลการซึมผ่านปลายน้ำและการติดฉลากสมดุล อย่าปล่อยให้ตัวอย่างแห้งในระหว่างการทดลอง ใส่ตัวอย่างที่ประมวลผลแล้วในกล่องเปียกเพื่อให้ตัวอย่างเปียก
1.1.5.2 มก./มล. สารละลายโปรตีเนสเคเจือจางด้วย PBS ในอัตราส่วน 1:100 เพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้าย 20 μg/มล.
1.1.6. เติมสารละลายโปรตีเนสเค 100 μL ที่ความเข้มข้น 20 μg/mL ลงในแต่ละตัวอย่างเพื่อให้คลุมตัวอย่างอย่างสมบูรณ์ แล้วฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 นาที
[หมายเหตุ]: โปรตีเนสเคช่วยให้เนื้อเยื่อและเซลล์สามารถผ่านเข้าไปในสารย้อมสีในขั้นตอนต่อไปได้ เวลาบ่มนานเกินไปจะเพิ่มความเสี่ยงที่เนื้อเยื่อบางส่วนจะหลุดออกจากแผ่นพาหะในขั้นตอนการล้างครั้งต่อไป ในขณะที่เวลาบ่มสั้นเกินไปอาจทำให้การบำบัดด้วยการซึมผ่านไม่เพียงพอและส่งผลต่อประสิทธิภาพการติดฉลาก เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีขึ้น อาจจำเป็นต้องปรับเวลาบ่มของโปรตีเนสเคให้เหมาะสม
1.1.7. ล้างตัวอย่างด้วยสารละลาย PBS 2-3 ครั้ง ค่อยๆ กำจัดของเหลวส่วนเกินออก และซับของเหลวรอบตัวอย่างบนสไลด์ด้วยกระดาษกรองอย่างระมัดระวัง ตัวอย่างที่ผ่านการประมวลผลแล้วจะถูกวางไว้ในกล่องเปียกเพื่อรักษาความชื้นของตัวอย่าง
1.2 ส่วนของเนื้อเยื่อที่แช่แข็ง
1.2.1. นำส่วนที่แช่แข็งออกแล้วนำกลับมาไว้ที่อุณหภูมิห้อง จุ่มสไลด์ลงในสารละลายพาราฟอร์มาลดีไฮด์ 4% (ละลายใน PBS) แล้วตรึงไว้และฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที
1.2.2. ค่อยๆ กำจัดของเหลวส่วนเกินออก แล้วใช้กระดาษกรองซับของเหลวส่วนเกินรอบๆ ตัวอย่างบนสไลด์แก้วอย่างระมัดระวัง
1.2.3. จุ่มสไลด์ลงในสารละลาย PBS ฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที และล้างด้วย PBS อีกครั้ง รวม 2 ครั้ง
1.2.4. ค่อยๆ เอาของเหลวส่วนเกินออกและซับสไลด์แก้วด้วยกระดาษกรองอย่างระมัดระวังเพื่อเอาของเหลวส่วนเกินรอบตัวอย่างออก ในกรณีนี้ สามารถใช้ปากกาพาราฟินหรือปากกาไฮโดรโฟบิกเพื่อวาดโครงร่างของการกระจายตัวอย่างรอบตัวอย่าง ซึ่งสะดวกสำหรับการประมวลผลการซึมผ่านปลายน้ำและการติดฉลากสมดุล ในระหว่างการทดลอง อย่าปล่อยให้ตัวอย่างแห้ง และใส่ตัวอย่างที่ประมวลผลแล้วในกล่องเปียกเพื่อให้ตัวอย่างเปียก
1.2.5. เจือจางสารละลายโปรตีเนสเค 2 มก./มล. ด้วย PBS ในอัตราส่วน 1:100 เพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้าย 20 μg/มล.
1.2.6. เติมสารละลายโปรตีเนสเค 100 μL ที่ความเข้มข้น 20 μg/mL ลงในแต่ละตัวอย่างเพื่อให้คลุมตัวอย่างอย่างสมบูรณ์ แล้วฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที
[หมายเหตุ]: โปรตีเนสเคช่วยให้เนื้อเยื่อและเซลล์สามารถผ่านเข้าไปในสารย้อมสีในขั้นตอนต่อไปได้ เวลาบ่มนานเกินไปจะเพิ่มความเสี่ยงที่เนื้อเยื่อบางส่วนจะหลุดออกจากแผ่นพาหะในขั้นตอนการล้างครั้งต่อไป ในขณะที่เวลาบ่มสั้นเกินไปอาจทำให้การบำบัดด้วยการซึมผ่านไม่เพียงพอและส่งผลต่อประสิทธิภาพการติดฉลาก อาจจำเป็นต้องปรับเวลาบ่มโปรตีเนสเคให้เหมาะสมหากไม่ได้ผลลัพธ์ที่ดีขึ้น
1.2.7 ล้างตัวอย่าง 2-3 ครั้งในบีกเกอร์เปิดที่มีสารละลาย PBS
[หมายเหตุ]: เพื่อหลีกเลี่ยงการสูญเสียการลอกตัวอย่างในขั้นตอนการทำความสะอาด แนะนำให้ไม่ล้างขวด แต่ให้แช่สไลด์แก้วในสารละลาย PBS 2-3 ครั้งเพื่อทำความสะอาด
1.2.8. ค่อยๆ กำจัดของเหลวส่วนเกินออก แล้วใช้กระดาษกรองซับของเหลวรอบ ๆ ตัวอย่างบนสไลด์อย่างระมัดระวังตัวอย่างที่ผ่านการประมวลผลจะถูกวางไว้ในกล่องที่เปียกเพื่อรักษาความชื้นของตัวอย่าง
1.3 การเตรียมแผ่นข้อมูลการรวบรวมข้อมูลเซลล์
เซลล์ที่ยึดติดได้รับการเพาะเลี้ยงบน Lab-Tek ของ Chamber Slides หลังจากการบำบัดด้วยการเหนี่ยวนำอะพอพโทซิส สไลด์จะถูกล้างด้วย PBS สองครั้ง
1.4 การเตรียมแผ่นเซลล์สเมียร์ (ใช้แผ่นสไลด์เคลือบโพลีไลซีนเป็นตัวอย่าง)
1.4.1. เซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ใน PBS ที่ความเข้มข้นประมาณ 2 × 107 เซลล์/มล. ดูดเซลล์ที่แขวนลอย 50-100 μL ลงบนสไลด์เคลือบโพลีไลซีน จากนั้นค่อยๆ เกลี่ยเซลล์ที่แขวนลอยออกด้วยสไลด์ที่สะอาด
1.4.2. ตรึงเซลล์และจุ่มสไลด์ในถังย้อมสีที่มีพาราฟอร์มาลดีไฮด์ที่เตรียมใหม่ใน PBS 4% และวางไว้ที่ 4°C เป็นเวลา 25 นาที
1.4.3. ล้างสไลด์ จุ่มใน PBS แล้วทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที ล้างด้วย PBS อีกครั้ง
1.4.4. ค่อยๆ เอาของเหลวส่วนเกินออกและซับสไลด์แก้วด้วยกระดาษกรองอย่างระมัดระวังเพื่อเอาของเหลวส่วนเกินรอบตัวอย่างออก ในกรณีนี้ สามารถใช้ปากกาพาราฟินหรือปากกาไฮโดรโฟบิกเพื่อร่างโครงร่างการกระจายของตัวอย่างรอบตัวอย่างเพื่ออำนวยความสะดวกในการประมวลผลการซึมผ่านปลายน้ำและการติดฉลากสมดุล ระหว่างการทดลอง อย่าปล่อยให้ตัวอย่างแห้ง และใส่ตัวอย่างที่ประมวลผลแล้วในกล่องเปียกเพื่อให้ตัวอย่างยังคงเปียกอยู่
1.4.5. เจือจางสารละลายโปรตีเนสเค 2 มก./มล. ด้วย PBS ในอัตราส่วน 1:100 เพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้าย 20 μg/มล.
1.4.6. เติมสารละลายโปรตีเนสเค 100 μL ที่ความเข้มข้น 20 μg/mL ลงในแต่ละตัวอย่างเพื่อให้เคลือบอย่างทั่วถึง แล้วฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที (หรืออาจจุ่มในสารละลาย 0.2% Triton X-100 ที่เตรียมใน PBS แล้วฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาทีเพื่อการบำบัดการซึมผ่าน)
[หมายเหตุ]: โปรตีเนสเคช่วยให้เนื้อเยื่อและเซลล์สามารถผ่านเข้าไปในสารย้อมสีในขั้นตอนต่อไปได้ เวลาบ่มนานเกินไปจะเพิ่มความเสี่ยงที่เนื้อเยื่อบางส่วนจะหลุดออกจากแผ่นพาหะในขั้นตอนการล้างครั้งต่อไป ในขณะที่เวลาบ่มสั้นเกินไปอาจทำให้การบำบัดด้วยการซึมผ่านไม่เพียงพอและส่งผลต่อประสิทธิภาพการติดฉลาก อาจจำเป็นต้องปรับเวลาบ่มโปรตีเนสเคให้เหมาะสมหากไม่ได้ผลลัพธ์ที่ดีขึ้น
1.4.7. ล้างตัวอย่างด้วย PBS 2-3 ครั้ง ค่อยๆ กำจัดของเหลวส่วนเกินออก และซับของเหลวรอบตัวอย่างบนสไลด์ด้วยกระดาษกรองอย่างระมัดระวัง ตัวอย่างที่ผ่านการประมวลผลแล้วจะถูกวางไว้ในกล่องที่เปียก
2. ขั้นตอนการบำบัด DNase ของตัวควบคุมเชิงบวก
หลังจากตัวอย่างผ่านการซึมผ่าน เซลล์ได้รับการบำบัดด้วย DNase I เพื่อเตรียมสไลด์ควบคุมเชิงบวก กระบวนการนี้มักทำให้เซลล์ส่วนใหญ่ ได้รับการปรับให้แสดงการเรืองแสงสีเขียว
[หมายเหตุ]: การบำบัดด้วย Dnase I ของเซลล์ที่เคลื่อนที่ไม่ได้ทำให้ DNA ของโครโมโซมแตกหัก ส่งผลให้ DNA มีปลาย 3 ' จำนวนมากที่สามารถติดฉลากได้
2.1. เจือจางบัฟเฟอร์ 10 × DNase I ด้วยน้ำดีไอออนไนซ์ในอัตราส่วน 1:10 (ต้องใช้บัฟเฟอร์ 1× DNase I 200 µL สำหรับแต่ละตัวอย่าง นั่นคือ ต้องใช้บัฟเฟอร์ 10 × DNase I 20 µL และน้ำดีไอออนไนซ์ 180 µL เพื่อเจือจาง) หยดสารละลาย 100 µl ลงในตัวอย่างที่ซึมผ่านได้ แล้วฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที เติม DNase I 1 µL (1U/μL) ลงในบัฟเฟอร์ 1 × DNase I 100 µL ที่เหลือเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้าย 10 U/mL
2.2. ค่อยๆ เคาะของเหลวออก จากนั้นเติมบัฟเฟอร์ที่มี DNase I 10 U/mL ปริมาตร 100 μL ลงไป แล้วฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที
2.3 เคาะสไลด์เพื่อเอาของเหลวส่วนเกินออก และล้างสไลด์ให้สะอาด 3-4 ครั้งในถังสีด้วยน้ำดีไอออนไนซ์
[หมายเหตุ]: ต้องใช้ถังย้อมแยกต่างหากสำหรับสไลด์ควบคุมเชิงบวก มิฉะนั้น DNase I ที่เหลืออยู่บนสไลด์ควบคุมเชิงบวกอาจทำให้สไลด์ทดลองมีพื้นหลังสูงได้
3. การติดฉลากและการตรวจจับ
3.1.บัฟเฟอร์สมดุล (5 × บัฟเฟอร์สมดุล) เจือจางด้วยน้ำที่ผ่านการดีไอออนไนซ์ในอัตราส่วน 1:5 (ต้องใช้บัฟเฟอร์สมดุล 1 × 100μL สำหรับแต่ละตัวอย่าง)
3.2. เติมบัฟเฟอร์ปรับสมดุล (100μL 1× บัฟเฟอร์ปรับสมดุล) ลงในแต่ละตัวอย่างเพื่อปรับสมดุลพื้นที่อย่างสมบูรณ์ และฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10-30 นาที หรืออีกวิธีหนึ่งคือ เลื่อนลงใน VAT พร้อมบัฟเฟอร์ปรับสมดุล 1 x เพื่อให้แน่ใจว่าสไลด์ได้รับการปรับสมดุลแล้ว ละลายน้ำแข็งในขณะที่ปรับสมดุลเซลล์ และเตรียมบัฟเฟอร์บ่มเพาะ TdT ให้เพียงพอสำหรับการทดลองทั้งหมดและปฏิกิริยาควบคุมเชิงบวกตามตัวเลือกตามตารางที่ 1 สำหรับปฏิกิริยามาตรฐานที่มีพื้นที่น้อยกว่า 5 ซม.2 ปริมาตรคือ 50 μl และคูณ 50 μl ด้วยจำนวนปฏิกิริยาทดลองและปฏิกิริยาควบคุมเชิงบวกเพื่อกำหนดปริมาตรรวมของบัฟเฟอร์บ่มเพาะ TdT ที่ต้องการ สำหรับตัวอย่างที่มีพื้นที่ผิวใหญ่กว่า ปริมาตรของรีเอเจนต์สามารถเพิ่มขึ้นได้ตามสัดส่วน

ตารางที่ 1 บัฟเฟอร์บ่มเพาะ TdT ที่เตรียมไว้สำหรับการทดลองและปฏิกิริยาควบคุมเชิงบวกที่เป็นทางเลือก

[ระบบควบคุมเชิงลบ] : มีการเตรียมบัฟเฟอร์ฟักควบคุมโดยไม่ใช้เอนไซม์ TdT และเอนไซม์ TdT ถูกแทนที่ด้วย ddH2O
3.3. บัฟเฟอร์ปรับสมดุล 1× ขนาด 100 μl ส่วนใหญ่ถูกชะล้างออกด้วยกระดาษดูดซับรอบ ๆ บริเวณที่ปรับสมดุล จากนั้นจึงเติมบัฟเฟอร์บ่มเพาะ TdT ขนาด 50 μl ลงในพื้นที่เซลล์ขนาด 5 ซม.2 อย่าปล่อยให้เซลล์แห้ง หลังจากนั้น ควรปกป้องสไลด์จากแสง
3.4. วางแผ่นพลาสติกคลุมเซลล์เพื่อให้แน่ใจว่าสารเคมีกระจายตัวทั่วถึง และวางกระดาษเช็ดมือชุบน้ำที่ด้านล่างของกล่องเปียก วางสไลด์ในกล่องเปียกและฟักที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 60 นาที ห่อกล่องเปียกด้วยกระดาษฟอยล์เพื่อป้องกันแสง
[หมายเหตุ]: สามารถตัดฝาครอบกระจกพลาสติกออกเป็นครึ่งหนึ่งก่อนใช้งาน พับขอบฝาครอบกระจกเพื่อให้ถอดและจัดการได้ง่าย
3.5. ถอดแผ่นพลาสติกคลุมออก แล้วฟักส่วนต่างๆ ในสารละลาย PBS ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที จากนั้นล้างส่วนต่างๆ ด้วย PBS สดสองครั้ง
3.6 เช็ดสารละลาย PBS รอบๆ และด้านหลังของตัวอย่างเบาๆ ด้วยกระดาษกรอง
[หมายเหตุ]: เพื่อลดพื้นหลัง หลังจากล้างสไลด์ด้วย PBS หนึ่งครั้งแล้ว สามารถล้างด้วย PBS ที่ประกอบด้วย Triton X-100 0.1% และ BSA 5 มก./มล. 3 ครั้ง ครั้งละ 5 นาที เพื่อให้เครื่องหมายที่ยังไม่ได้ทำปฏิกิริยาใสและสะอาด
3.7. ตัวอย่างถูกย้อมในถังย้อม และสไลด์ถูกจุ่มลงในถังย้อมที่มีสารละลาย PI (1 μg/mL เตรียมใหม่และเจือจางด้วย PBS) ในที่มืด และทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที (ทางเลือก): ตัวอย่างถูกย้อมในถังย้อม และสไลด์ถูกจุ่มลงในถังย้อมที่มีสารละลาย DAPI (2 μg/mL เตรียมใหม่และเจือจางด้วย PBS) ในที่มืด และทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที
3.8.ล้างตัวอย่าง จุ่มสไลด์ลงในน้ำดีไอออนไนซ์ แล้วทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที ทำซ้ำ 2 ครั้ง รวมเป็น 3 ครั้ง
3.9. ทำให้น้ำส่วนเกินบนสไลด์แห้ง และเติม PBS 100 μl ลงในพื้นที่ตัวอย่างเพื่อรักษาความชื้นของตัวอย่าง
3.10. วิเคราะห์ตัวอย่างทันทีภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ และสังเกตเห็นฟลูออเรสเซนต์สีเขียวที่ 520±20 นาโนเมตรโดยใช้ตัวกรองฟลูออเรสเซนต์มาตรฐาน สังเกตเห็นฟลูออเรสเซนต์สีแดงของ PI ที่ > 620 นาโนเมตร หรือสังเกตเห็น DAPI สีน้ำเงินที่ 460 นาโนเมตร หากจำเป็น สามารถเก็บสไลด์ไว้ข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4°C ในที่มืดได้
[หมายเหตุ]: PI/DAPI สามารถย้อมทั้งเซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสและไม่เกิดอะพอพโทซิสให้เป็นสีแดง/น้ำเงิน และเฉพาะในนิวเคลียสที่เกิดอะพอพโทซิสเท่านั้นที่มีการรวม Alexa Fluor 488-12-DUTP และทำให้เรืองแสงสีเขียวเฉพาะที่
4. ตรวจหาเซลล์แขวนลอยด้วยการไหลเวียนไซโตเมทรี
4.1. ล้างเซลล์ขนาด 3~5 × 106 เซลล์ด้วย PBS สองครั้งโดยการปั่นเหวี่ยง (300 × g) ที่อุณหภูมิ 4 °C ปั่นเหวี่ยงด้วยอัตรา 300 g ที่อุณหภูมิ 4 °C เป็นเวลา 10 นาที แล้วจึงนำไปแขวนลอยใหม่ใน PBS ปริมาตร 0.5 มล.
4.2. ตรึงเซลล์แล้วเติมสารละลายพาราฟอร์มาลดีไฮด์ 1% จำนวน 5 มิลลิลิตรที่เตรียมใน PBS ลงไปแล้ววางบนน้ำแข็งเป็นเวลา 20 นาที
4.3. เหวี่ยงเซลล์ด้วยความเร็ว 300 × g ที่อุณหภูมิ 4 °C เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นนำส่วนที่เป็นของเหลวใสออกแล้วแขวนลอยใหม่ใน PBS ปริมาตร 5 มล. ทำซ้ำการล้างหนึ่งครั้งแล้วแขวนลอยเซลล์ด้วย PBS ปริมาตร 0.5 มล.
4.4. เซลล์ถูกแทรกซึมเข้าไป และเติมเอธานอล 70% ที่ผ่านการทำให้เย็นลงด้วยน้ำแข็ง 5 มล. และฟักที่อุณหภูมิ -20 °C เป็นเวลา 4 ชั่วโมง เซลล์สามารถเก็บในเอธานอล 70% ที่อุณหภูมิ -20℃ เป็นเวลา 1 สัปดาห์ หรือเซลล์สามารถซึมผ่านได้ด้วยสารละลาย Triton X-100 0.2% ที่เตรียมใน PBS และเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที
4.5. ปั่นเหวี่ยงเซลล์ด้วยอัตรา 300 × g เป็นเวลา 10 นาที แล้วนำไปแขวนลอยใน PBS ปริมาตร 5 มล. ปั่นเหวี่ยงซ้ำแล้วซ้ำอีก แล้วนำไปแขวนลอยใน PBS ปริมาตร 1 มล.
4.6. ถ่ายโอนเซลล์ขนาด 2×106 ลงในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ขนาด 1.5 มล.
4.7. ปั่นเหวี่ยงเพื่อปรับสมดุลที่ 300×g เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นนำส่วนที่เป็นของเหลวใสออกแล้วทำให้แขวนลอยใหม่ด้วยบัฟเฟอร์ปรับสมดุล 1×80 μL ฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที
4.8. ในระหว่างการปรับสมดุลเซลล์ ให้ละลาย Alexa Fluor 488-12-DUTP Labeling Mix บนน้ำแข็ง และเตรียมบัฟเฟอร์บ่มเพาะ TdT เพียงพอสำหรับปฏิกิริยาทั้งหมดตามตารางที่ 1 สำหรับปฏิกิริยามาตรฐานของเซลล์ 2×106 เซลล์ ปริมาตรคือ 50 μL และ 50 μL คูณจำนวนปฏิกิริยาคือปริมาตรรวมของบัฟเฟอร์บ่มเพาะ TdT ที่ต้องการ
4.9. เหวี่ยงเซลล์ด้วยแรงเหวี่ยง 300×g เป็นเวลา 10 นาที นำส่วนที่เป็นของเหลวใสออก แล้วนำตะกอนกลับมาแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์บ่มเพาะ TdT ปริมาตร 50 μL แล้วบ่มที่อุณหภูมิ 37℃ เป็นเวลา 60 นาที โดยไม่ให้โดนแสง เซลล์จะถูกแขวนลอยใหม่เบาๆ ทุกๆ 15 นาทีด้วยไมโครปิเปต
4.10. ปฏิกิริยาสิ้นสุดลงโดยการเติม EDTA ความเข้มข้น 20 มิลลิโมลาร์ ปริมาณ 1 มิลลิลิตร และผสมเบาๆ ด้วยไมโครปิเปต
4.11. หลังจากปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็ว 300 กรัม เป็นเวลา 10 นาที ให้ทิ้งของเหลวส่วนบนออก แล้วนำตะกอนกลับเข้าสู่สภาวะแขวนลอยอีกครั้งในสารละลาย Triton X-100 0.1% ปริมาตร 1 มล. ที่เตรียมใน PBS ที่มี BSA 5 มก./มล. ทำซ้ำสารละลายหนึ่งครั้งและล้างทั้งหมดสองครั้ง
4.12. ทิ้งของเหลวส่วนบนด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 300 g เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นนำเซลล์กลับมาแขวนลอยใหม่ในสารละลาย 0.5 mL ของ 5 μg/mLPI ที่เตรียมใหม่ด้วย PBS ซึ่งมี DNase-free RNase A 250 μg
4.13. ฟักเซลล์ในที่มืดเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง
4.14. เซลล์ได้รับการวิเคราะห์ด้วยการไหลเวียนของไซโตเมทรี และสังเกตเห็นการเรืองแสงสีเขียวที่ความยาวคลื่น 520±20 นาโนเมตร การเรืองแสงสีแดงของ PI สังเกตเห็นที่ความยาวคลื่น > 620 นาโนเมตร PI สามารถย้อมทั้งเซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสและเซลล์ที่ไม่เกิดอะพอพโทซิสให้เป็นสีแดง และในนิวเคลียสที่เกิดอะพอพโทซิสเท่านั้นที่มีการเรืองแสงสีเขียวที่รวมอยู่และอยู่ในตำแหน่งเฉพาะ