คำแนะนำ

1. การเตรียมตัวก่อนการทดลอง

1） เตรียมสารเคมีและวัสดุที่จำเป็นที่จะใช้ในการทดลอง

2）ยืนยันความเหมาะสมของ เครื่องมือ qPCR

ชุดอุปกรณ์นี้สามารถใช้กับเครื่องมือ qPCR ชนิดต่างๆ ดังต่อไปนี้:

1. ไบโอ-ราด: CFX96
2. Thermo Scientific: ระบบ PCR แบบเรียลไทม์ 7500；QuantStudio™5；
3. วิธีการทดลอง

1） การสกัดดีเอ็นเอ

เราแนะนำให้ใช้ - ชุดเตรียมตัวอย่าง DNA ตกค้างแม่เหล็ก (Cat#18461ES สำหรับ การสกัดด้วยมือและ Cat#18462ES สำหรับ การสกัดอัตโนมัติ) สำหรับ การสกัดดีเอ็นเอ คุณ สามารถ เยี่ยม - http:/www.yeasenbiotech.com -  สำหรับ เดอะ

ข้อมูลรายละเอียดและการจัดซื้อ

ชุดทดสอบ (Cat#40619ES) ประกอบด้วยตัวควบคุมภายใน (IC) หากเติม IC ลงในตัวอย่างก่อนสกัด DNA ก็จะสามารถตรวจสอบกระบวนการทั้งหมดได้ (รวมถึงการสกัด DNA และปฏิกิริยา qPCR) หากเติม IC ลงในส่วนผสมหลักของ qPCR

โดยตรง, IC จะทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม qPCR เท่านั้น

2）การเตรียมส่วนผสม qPCR

1. ตามจำนวนตัวอย่างซึ่งรวมถึงการควบคุมเชิงบวก (PCS), ไม่มีการควบคุมเทมเพลต (NTC), การควบคุมเชิงลบ  สารละลายควบคุม (NCS) และตัวอย่างทดสอบ (TS) เพื่อคำนวณจำนวนปฏิกิริยา เตรียมปฏิกิริยา 2 ปฏิกิริยาขนานกัน

แต่ละตัวอย่างโดยทั่วไป

- PCS: ผลเป็นบวก ควบคุม วิธีแก้ปัญหา；NTC：ไม่มี เทมเพลต การควบคุม；NCS：เชิงลบ ควบคุม วิธีแก้ปัญหา；TS：การทดสอบ ตัวอย่าง.มี เป็น เลขที่ ความต้องการ ถึง ดำเนินการ

เดอะ ตัวอย่าง การสกัด สำหรับ พีซีเอส และ กทช. แต่ เอ็นซีเอส และ ทีเอส เป็น จำเป็น.

บ่อน้ำปฏิกิริยา (M1) = （1×NCS + น×ทีเอส） ×2

บ่อน้ำปฏิกิริยา (M2) = （1×PCS + 1×NTC） ×2

บ่อน้ำปฏิกิริยา (M3) = （1×PCS + 1×NTC+ N×TS） ×2

1. ละลายสารเคมีในปริมาณที่ต้องการบนน้ำแข็งล่วงหน้าตามการออกแบบการทดลองและตารางด้านล่าง
2. คำนวณปริมาณของ qPCR Mix ตามจำนวนปฏิกิริยา โปรดทราบว่าหากจะใช้ชุดอุปกรณ์สำหรับกิจกรรม GMP เช่น การปล่อยผลิตภัณฑ์ เราขอแนะนำให้ใช้ตาราง 1 และ 2 สำหรับการเตรียม ชุดจะ แค่ ใช้ในการวิจัยและไม่จำเป็นต้องเติม IC ก่อนการสกัดหลังการประเมิน จากนั้นทำตามตารางที่ 3

การเตรียมตัว โปรดทราบว่าไม่ใช่ M1, M2 และ M3 ทั้งหมด เป็น จำเป็นที่จะต้อง เป็น เตรียมตัว.

ตารางที่ 1 ระบบผสม qPCR สำหรับ M1

*การ การกำหนดค่า ระบบ ใน โต๊ะ 1 คือ ซึ่งเป็นรากฐาน บน เดอะ สถานที่ตั้ง ที่ ไอซี เป็น เพิ่ม ก่อน การสกัด สำหรับ ทั้งคู่ เอ็นซีเอส และ TS น่ะสิ มัน เป็น ไม่ จำเป็น

ถึง เพิ่ม ไอซี เมื่อไร คิวพีซีอาร์ ผสม การเตรียมพร้อม.IC การเพิ่ม วิธี ก่อน การสกัด: ขั้นแรกให้เจือจาง ไอซี โดย 20 ครั้ง กับ ดีเอ็นเอ สารเจือจาง และ เพิ่ม 1 ไมโครลิตร

เจือจาง ไอซี เข้าไปข้างใน แต่ละ 100ไมโครลิตร ทดสอบ ตัวอย่าง สำหรับ เดอะ ไกลออกไป การสกัด

**นี้ ชุด ทำ ไม่ บรรจุ ร็อกซ์ อ้างอิง ย้อม. ถ้า ร็อกซ์ อ้างอิง ย้อม เป็น จำเป็น สำหรับ เดอะ จริง เวลา พีซีอาร์ เครื่องขยายเสียง ที่ คุณ เป็น ตอนนี้ โดยใช้, 50×ร็อกซ์ อ้างอิง ย้อม (Cat#10200ES) คือ ที่แนะนำ สำหรับ ใช้. ใน นี้ กรณีที่ เพิ่ม ปริมาณ เป็น 0.8 ไมโครลิตร เช่น แสดง ใน โต๊ะ 1. ถ้า โดยใช้ อื่น

แบรนด์ ของ ร็อกซ์ สินค้ากรุณา อ้างอิง ถึง ของพวกเขา คำแนะนำ สำหรับ ร็อกซ์ ส่วนที่เพิ่มเข้าไป.ถ้า เลขที่ ร็อกซ์ อ้างอิง ย้อม เป็น จำเป็นต้องมี เพิ่ม ปริมาณ เป็น 0 ไมโครลิตร

ตารางที่ 2 ระบบผสม qPCR สำหรับ M2

*การ การกำหนดค่า ระบบ ใน โต๊ะ 2 เป็น ซึ่งเป็นรากฐาน บน เดอะ สถานที่ตั้ง ที่ ไอซี เป็น ไม่ เพิ่ม ใน พีซีเอส และ กทช. ก่อน การสกัด ดังนั้น ไอซี ความต้องการ ถึง เป็น เพิ่ม ในระหว่าง คิวพีซีอาร์ ผสม การเตรียมพร้อม.IC การเพิ่ม วิธี หลังจาก การสกัด: เจือจาง ไอซี โดย 100 ครั้ง กับ ดีเอ็นเอ สารเจือจาง และ เพิ่ม 1 ไมโครลิตร เจือจาง ไอซี เข้าไปข้างใน

แต่ละ คิวพีซีอาร์ ผสม ระบบ.

**นี้ ชุด ทำ ไม่ บรรจุ ร็อกซ์ อ้างอิง ย้อม. ถ้า ร็อกซ์ อ้างอิง ย้อม เป็น จำเป็น สำหรับ เดอะ จริง เวลา พีซีอาร์ เครื่องขยายเสียง ที่ คุณ เป็น ตอนนี้ โดยใช้, 50×ร็อกซ์ อ้างอิง ย้อม (Cat#10200ES) คือ ที่แนะนำ สำหรับ ใช้. ใน นี้ กรณีที่ เพิ่ม ปริมาณ เป็น 0.8 ไมโครลิตร เช่น แสดง ใน โต๊ะ 1. ถ้า โดยใช้ อื่น

แบรนด์ ของ ร็อกซ์ สินค้ากรุณา อ้างอิง ถึง ของพวกเขา คำแนะนำ สำหรับ ร็อกซ์ การบวก ถ้า เลขที่ ร็อกซ์ อ้างอิง ย้อม เป็น จำเป็นต้องมี เพิ่ม ปริมาณ เป็น 0 ไมโครลิตร

ตารางที่ 3 ระบบผสม qPCR สำหรับ M3

*การ การกำหนดค่า ระบบ ใน โต๊ะ 3 คือ ซึ่งเป็นรากฐาน บน เดอะ สถานที่ตั้ง ที่ ไอซี เป็น ไม่ เพิ่ม ถึง ตัวอย่าง ก่อน การสกัดดังนั้น ไอซี ความต้องการ ถึง เป็น เพิ่ม    ในระหว่าง คิวพีซีอาร์ ผสม การเตรียมพร้อม.IC การเพิ่ม วิธี หลังจาก การสกัด: เจือจาง ไอซี โดย 100 ครั้ง กับ ดีเอ็นเอ สารเจือจาง และ เพิ่ม 1 ไมโครลิตร เข้าไปข้างใน แต่ละ คิวพีซีอาร์ ผสม

ระบบ.

**นี้ ชุด ทำ ไม่ บรรจุ ร็อกซ์ อ้างอิง ย้อม. ถ้า ร็อกซ์ อ้างอิง ย้อม เป็น จำเป็น สำหรับ เดอะ จริง เวลา พีซีอาร์ เครื่องขยายเสียง ที่ คุณ เป็น ตอนนี้ โดยใช้, 50×ร็อกซ์ อ้างอิง ย้อม (Cat#10200ES) คือ ที่แนะนำ สำหรับ ใช้. ใน นี้ กรณีที่ เพิ่ม ปริมาณ เป็น 0.8 ไมโครลิตร เช่น แสดง ใน โต๊ะ 1. ถ้า โดยใช้ อื่น

แบรนด์ ของ ร็อกซ์ สินค้ากรุณา อ้างอิง ถึง ของพวกเขา คำแนะนำ สำหรับ ร็อกซ์ การบวก ถ้า เลขที่ ร็อกซ์ อ้างอิง ย้อม เป็น จำเป็นต้องมี เพิ่ม ปริมาณ เป็น 0 ไมโครลิตร

3）การเพิ่มเทมเพลต

1. ผสม qPCR Mix ด้วยการเขย่าอย่างเพียงพอ ปั่นด้วยความเร็วต่ำ และเก็บของเหลวที่เหลือจากฝา

ไปจนถึงก้น ท่อ

1. เพิ่ม 20 µL ของ qPCR Mix ในแต่ละหลอดปฏิกิริยา/หลุม โปรดทราบว่าให้เติม qPCR Mix ที่เกี่ยวข้องลงในแต่ละหลอดปฏิกิริยา

หลอดตัวอย่างและหลีกเลี่ยงการเพิ่มข้อผิดพลาด

1. เพิ่มเทมเพลตลงในท่อ/หลุมที่บรรจุ qPCR Mix ดูตารางที่ 4 สำหรับเทมเพลตที่เพิ่ม

โต๊ะ 4 เทมเพลต การเพิ่ม

*เราขอแนะนำให้ใช้บัฟเฟอร์เจือจาง DNA (40619-E) เป็นแม่แบบของ NCS สำหรับการสกัด DNA

**การ ทั้งหมด ปฏิกิริยา ปริมาณ ใน แต่ละ ท่อ/บ่อน้ำ เป็น 40 ไมโครลิตร

***ปิดบัง เดอะ หลอด ฝา หรือ เดอะ จาน ฟิล์ม. หลีกเลี่ยง กระทบกระเทือน เดอะ การเรืองแสง สัญญาณ โปรดอ่านหน่อย เอา การดูแล ไม่ ถึง เครื่องหมาย เดอะ หลอด ฝา หรือ ฟิล์ม

หรือ สม่ำเสมอ ถู เดอะ ฟิล์ม ซ้ำแล้วซ้ำเล่า กับ เอ มีดโกน.

****เครื่องเหวี่ยง เดอะ ปฏิกิริยา หลอด หรือ จาน สั้นๆ ที่ ต่ำ ความเร็ว หลังจาก เทมเพลต การเพิ่ม หลังจาก เพียงพอ การสั่น และ การผสมซ้ำ เครื่องเหวี่ยง

ที่ ต่ำ ความเร็ว ถึง เก็บรวบรวม เดอะ ของเหลว จาก เดอะ ฝา หรือ กำแพง ถึง เดอะ ด้านล่าง หลีกเลี่ยง ฟองอากาศ เมื่อไร การดำเนินการ เส้นพื้นฐาน จะ เป็น ได้รับผลกระทบ ถ้า เดอะ ผสม

เป็น ไม่ ผสม เอาล่ะ นี้ ก้าว เป็น มาก สำคัญ ถึง เอ ดี การทดลอง ผลลัพธ์.

4）การตั้งค่าโปรแกรม qPCR

1. การตั้งค่าไฟล์โปรแกรม

ตัวอย่าง (เครื่องมือระบบ Real-Time PCR 7500 และซอฟต์แวร์ Real-Time PCR v2.4):

ประเภทเครื่องดนตรี：7500 (96 เวลส์)

ประเภทการทดลอง：การวิเคราะห์เชิงปริมาณ-กราฟมาตรฐาน

เคมี: สารเคมี Taqman®

ความเร็วการวิ่ง: มาตรฐาน (~2 ชั่วโมงในการวิ่งให้เสร็จ)

1. การตั้งค่าช่องเป้าหมาย

ใน "กำหนด เป้าหมาย และ "ตัวอย่าง" ของ "จาน การตั้งค่า", สร้าง เอ เป้า 1 ช่อง (ครอบครัว), เลือก ครอบครัว เช่น เดอะ การรายงาน กลุ่มเรืองแสงและ เอ็มจีบี หรือ ไม่มี เป็นการดับ การเรืองแสง กลุ่ม. สร้าง เอ เป้า 2 ช่อง (วิค) เลือก เดอะ การรายงาน การเรืองแสง กลุ่ม เช่น วิค และ เดอะ การดับ การเรืองแสง กลุ่ม เช่น ไม่มี. ใน "กำหนด เป้าหมาย และ ตัวอย่าง" ของ "จาน การตั้งค่า", ถ้า เลขที่ เพิ่มเติม ร็อกซ์ ย้อม เป็น เพิ่ม, เลือก "ไม่มี"; หากมีการ เพิ่มเติม ร็อกซ์ เป็น เพิ่ม, เลือก

ร็อกซ์

1. การตั้งค่าโปรแกรมขยายเสียงมาตรฐาน

ตารางที่ 5 การตั้งค่าโปรแกรมขยายเสียงมาตรฐาน

1. การตั้งค่าพื้นฐานและเกณฑ์:

หลักการ ของ เส้นพื้นฐาน การปรับเปลี่ยน: ใช้ เดอะ อัตโนมัติ เส้นพื้นฐาน โดยทั่วไป. ถ้า ความต้องการ ถึง ปรับ ใน คู่มือ, เลือก เดอะ วงจร ก่อนการเติบโตแบบทวีคูณ ช่วงเป็นช่วงเริ่มต้นของรอบ และหลีกเลี่ยงโซนผันผวนของ อักษรย่อ การเรืองแสง คอลเลกชัน เลือกรอบที่ 1-2 รอบก่อน Ct ของตัวอย่างการขยายแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลที่เร็วที่สุดเป็น

จุดสิ้นสุด

หลักการ ของ เกณฑ์ การปรับ: โดยทั่วไปจะใช้เกณฑ์อัตโนมัติ หากจำเป็นต้องปรับด้วยตนเอง เกณฑ์จะปรับตาม ควร เป็น ชุด สูงกว่า กว่า เดอะ เชิงลบ ตัวอย่าง หรือ เดอะ เส้นพื้นฐาน เสียงรบกวน, ของมัน โดยทั่วไป ชุด เกณฑ์ ใน เดอะ ช้า

ระยะของ ต้องใช้การขยายแบบเลขชี้กำลัง เกณฑ์อิสระที่สัมพันธ์กัน และเกณฑ์ที่เหมาะสมสำหรับอุโมงค์แต่ละแห่ง

5） ผลลัพธ์ การวิเคราะห์

1. ผลการตัดสินสำหรับ PCS, NTC และ NCS:

หากเพิ่ม IC: ควรระบุรายละเอียดของแต่ละตัวอย่างควบคุม เป็นไปตามตารางที่ 6:

โต๊ะ ผลลัพธ์ 6 การตัดสิน ของ พีซีเอส, กทช. และ เอ็นซีเอส

หากไม่ได้เพิ่ม IC: ตัวอย่างการควบคุมคุณภาพแต่ละตัวอย่างจะต้องเป็นไปตามข้อกำหนดของคอลัมน์สัญญาณ FAM ในตาราง 6 และไม่มี

ต้องวิเคราะห์ ช่อง VIC

1. ผลการพิจารณาตัดสิน TS

ข้อกำหนดเบื้องต้น: มัน เป็น จำเป็นต้องพิจารณาว่า พีซีเอส, กทช. และ เอ็นซีเอส ผ่านเกณฑ์แล้ว ในตาราง 6 ก่อนTS การวิเคราะห์ผลลัพธ์ ถ้าผ่านแล้วก็ทำได้ ดำเนินการต่อไป ขั้นตอนถัดไป ถ้าไม่ ผ่านไป, เดอะ ทีเอส ผลลัพธ์ อาจ ไม่ เป็น เชื่อถือได้, และ

สาเหตุจำเป็นต้องมีการสืบสวน.

ถ้าเพิ่ม IC เข้าไปจะพบผลลัพธ์ดังนี้ ตัดสินตามข้อมูลผลการแข่งขันของ FAM และ วิค ในตารางที่ 7:

โต๊ะ 7: ผลลัพธ์ การตัดสิน ของ ทีเอส (ไอซี เพิ่ม)

*ถ้า ที่นั่น เป็น การยับยั้ง สำหรับ วิค สัญญาณ,การรักษา เป็น จำเป็น ถึง กำจัด เดอะ สารยับยั้ง หรือ ทำซ้ำ เดอะ ทดสอบ.

ถ้าไม่ได้เพิ่ม IC: ค้นหาผลลัพธ์ที่สอดคล้องกัน การตัดสินตาม ข้อมูลผลลัพธ์ของ FAM ในตารางที่ 8 และไม่จำเป็นต้องวิเคราะห์ สัญญาณ VIC

โต๊ะ 8: ผลลัพธ์ การตัดสิน ของ ทีเอส (ไอซี ไม่ เพิ่ม)

หมายเหตุ

1. โปรดอ่านคู่มือนี้อย่างละเอียดก่อนใช้ชุดอุปกรณ์นี้ การทดลองควรดำเนินการในลักษณะมาตรฐาน รวมถึงการจัดการตัวอย่าง การเตรียมระบบปฏิกิริยา และการเติมตัวอย่าง

2. ให้ดำเนินการเติมตัวอย่างและเตรียมสารเคมีบนน้ำแข็งหากเป็นไปได้
3. ปั่นและผสมให้เข้ากันสำหรับสารเคมีแต่ละชนิดก่อนใช้งาน

4. โปรดปฏิบัติงานโดยสวมเสื้อคลุมแล็บและถุงมือแบบใช้แล้วทิ้ง ความปลอดภัยของคุณ
5. ผลิตภัณฑ์นี้ใช้เพื่อการวิจัยเท่านั้น