เวโร ชุดตรวจจับสารตกค้าง DNA ของเซลล์โฮสต์ใช้สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณของสารตกค้าง DNA ของเซลล์โฮสต์ Vero ในตัวอย่างระดับกลาง ผลิตภัณฑ์กึ่งสำเร็จรูป และผลิตภัณฑ์สำเร็จรูปของผลิตภัณฑ์ทางชีวภาพต่างๆ

ชุดนี้ใช้โพรบฟลูออเรสเซนต์ Taqman และวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ซึ่งมีขีดจำกัดการตรวจจับขั้นต่ำที่ระดับ fg และสามารถตรวจจับดีเอ็นเอเซลล์ Vero ที่เหลือได้อย่างรวดเร็วและเฉพาะเจาะจง ชุดนี้ต้องใช้ร่วมกับชุดเตรียมตัวอย่างดีเอ็นเอที่เหลือ (Cat# 18461ES)

ผลิตภัณฑ์ ส่วนประกอบ

^-IC：การควบคุมภายใน

การขนส่งและการเก็บรักษา

1. จัดส่งด้วยน้ำแข็งแห้ง และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ -20°C สำหรับ 2 ปี

2. หลังจากได้รับสินค้าโปรดตรวจสอบและจัดเก็บในอุณหภูมิการจัดเก็บที่เหมาะสมทันที

ข้อควรระวัง

1. โปรดอ่านคู่มือนี้อย่างละเอียดก่อนใช้สารเคมีนี้ และการทดลองควรได้มาตรฐาน ซึ่งรวมถึงการจัดการตัวอย่าง การเตรียมระบบปฏิกิริยา และการเติมตัวอย่าง

2. การเติมตัวอย่างและเตรียมสารละลายควรทำบนน้ำแข็ง

3. ตรวจสอบให้แน่ใจว่าส่วนประกอบแต่ละชิ้นถูกปั่นและปั่นด้วยความเร็วต่ำจนละเอียดก่อนใช้งาน

4. เพื่อความปลอดภัยและสุขภาพของคุณ โปรดสวมเสื้อคลุมแล็บและถุงมือแบบใช้แล้วทิ้งขณะผ่าตัด

5. ผลิตภัณฑ์นี้ใช้เพื่อการวิจัยเท่านั้น!

รุ่นเครื่องมือที่ใช้ได้

รวมถึงแต่ไม่จำกัดเพียง:

ไบโอ-ราด : โมดูลออปติก CFX96

เทอร์โม ไซเอนทิฟิค: เอบีไอ 7500; ABI Quant Studio 5; ABI Step OnePlus

การใช้คำแนะนำ

1. เวโร การเจือจางมาตรฐาน DNA และการเตรียมเส้นโค้งมาตรฐาน

เดอะเวโร การควบคุม DNA ถูกเจือจางแบบไล่ระดับโดยใช้บัฟเฟอร์เจือจาง DNA ที่ให้มาในชุด และความเข้มข้นของการเจือจางคือ 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL, 3 กรัม/ไมโครลิตร

ดูคำแนะนำโดยละเอียดด้านล่าง:

1.1 ละลายน้ำแข็ง เวโร บัฟเฟอร์ควบคุม DNA และเจือจาง DNA บนน้ำแข็ง หลังจากละลายหมดแล้ว ให้ปั่นเบาๆ เพื่อผสมให้เข้ากัน แล้วปั่นด้วยความเร็วต่ำเป็นเวลา 10 วินาที

1.2 นำออกหก หลอดสะอาดขนาด 1.5 มล. มีเครื่องหมาย 3 ng/μL, ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥

1.3 เติมบัฟเฟอร์เจือจาง DNA 90 μL และ Vero 10 μL การควบคุมดีเอ็นเอ ถึง 1.หลอดไมโครฟิวจ์ขนาด 5 มล. ติดฉลาก 3 ng/μL แล้วเจือจางเป็น 3 นาโนกรัมต่อไมโครลิตร ผสมแล้วปั่นเป็นเวลา 10 วินาที บรรจุมาตรฐาน DNA ที่เจือจางแล้วลงในบรรจุภัณฑ์ย่อย และสามารถเก็บไว้ได้ในระยะสั้น (ไม่เกิน 3 เดือน) ที่อุณหภูมิ -80°C โปรดหลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ

1.4 เติมบัฟเฟอร์เจือจาง DNA 90 μL ลงในส่วนอื่น หลอด จากนั้นทำตามขั้นตอนต่อไปนี้สำหรับการเจือจางแบบต่อเนื่อง

[หมายเหตุ]:

1. ต้องใช้หลุมจำลองสามหลุมสำหรับความเข้มข้นแต่ละแบบ ช่วงการตรวจจับคือ 3 ฟก./มล.-300พก./มล. และ สามารถขยายช่วงนี้ได้หากจำเป็น

2. เพื่อลดจำนวนครั้งของการแช่แข็งและละลายซ้ำและหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน ขอแนะนำให้จัดเก็บตัวควบคุม DNA ในส่วนย่อยที่อุณหภูมิ -80°C เป็นครั้งแรก

3. เมื่อละลายแล้ว บัฟเฟอร์เจือจาง DNA จะสามารถ เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 2-8°C เป็นเวลา 7 วัน หากไม่ได้ใช้งานเป็นเวลานาน โปรดเก็บที่อุณหภูมิ -20°C

4. ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเทมเพลตผสมเข้ากันดีแล้ว เขย่าส่วนผสมเบาๆ เป็นเวลา 15 วินาทีถึง 1 นาที สำหรับการเจือจางในแต่ละระดับ

2. การเตรียมการควบคุมการสกัดและการฟื้นฟู (ERC)

ตั้งค่าความเข้มข้น ของเวโร ดีเอ็นเอใน ERC ตามความจำเป็น (ตัวอย่าง ERC ได้เตรียมโดยใช้ DNA 3 pg/μL เป็นตัวอย่าง ดังนี้:

2.1 เติมตัวอย่างทดสอบ 100 μL ลงในหลอด 1.5 มล. ที่สะอาด จากนั้นเติม Vero 3pg/μL 10 μL มาตรฐาน DNA (③) และผสมให้เข้ากัน ทำเครื่องหมายเป็น ERC

2.2 ดำเนินการสกัด DNA จากตัวอย่าง ERC ร่วมกับตัวอย่างทดสอบเพื่อเตรียม ERC บริสุทธิ์ ตัวอย่าง.

3. การเตรียมตัวอย่างควบคุมเชิงบวก (PCS) (ทางเลือก)

ตั้งค่าความเข้มข้น ของเวโร ดีเอ็นเอใน PCS ตามความต้องการ (PCS ได้เตรียมโดยใช้ DNA 3 pg/μL เป็นตัวอย่าง ดังนี้:

3.1 เติม Vero 100 μL 3 pg/μL มาตรฐาน DNA (③) ลงในหลอดขนาด 1.5 มล. ที่สะอาด จากนั้นทำเครื่องหมายเป็น PCS

3.2 ดำเนินการสกัด DNA ของ PCS รวมทั้งตัวอย่างทดสอบเพื่อเตรียม PCS ที่ทำให้บริสุทธิ์

4. เชิงลบ การเตรียมสารละลายควบคุม (NCS)

ตั้งค่าการควบคุมเชิงลบในการทดลอง ขั้นตอนการดำเนินการเฉพาะมีดังนี้:

4.1 เติม 100 μL เมทริกซ์ตัวอย่าง (หรือบัฟเฟอร์เจือจาง DNA) ลงในหลอดขนาด 1.5 มล. ที่สะอาด จากนั้นทำเครื่องหมายเป็น NCS

4.2 ดำเนินการสกัด DNA จากตัวอย่าง NCS ร่วมกับตัวอย่างทดสอบเพื่อเตรียมตัวอย่าง NCS ที่บริสุทธิ์

5. การจัดเตรียมการควบคุมเทมเพลต (NTC)

ตั้งค่าเทมเพลตไม่มี การควบคุมในการทดลอง ขั้นตอนการดำเนินการเฉพาะมีดังนี้

5.1 NTC ไม่ต้องการการเตรียมตัวอย่างล่วงหน้าและสามารถกำหนดค่าได้ในขั้นตอนการตรวจจับเนื้อหา DNA ที่เหลือโดย qPCR

5.2 ตัวอย่าง NTC ในแต่ละหลอดหรือหลุมคือ 20 ไมโครลิตร ผสม (คือ 16 ไมโครลิตร เวโร qPCR มิกซ์ + 4 μL ไพรเมอร์และโพรบผสมเวโร + 20 μL บัฟเฟอร์เจือจาง DNA ขอแนะนำให้กำหนดค่าหลุมจำลองสามหลุม

6. ระบบปฏิกิริยา PCR

[หมายเหตุ]:

1. คำนวณปริมาตรปฏิกิริยา PCR ทั้งหมดตามจำนวนปฏิกิริยา: qPCR Mix =(จำนวนปฏิกิริยา+2) × (16+4) μL (รวมการสูญเสียของหลุมปฏิกิริยาสองหลุม) แนะนำให้ทำซ้ำมากกว่าสามครั้งสำหรับแต่ละตัวอย่างในการทดลอง

2. หลังจากปิดฝาหลอดหรือปิดผนึกแผ่นแล้ว ให้ปั่นหลอดปฏิกิริยาหรือแผ่นด้วยความเร็วต่ำเป็นเวลา 10 วินาที หลังจากเขย่าและผสมอย่างเพียงพอเป็นเวลา 5 วินาที ให้ปั่นซ้ำเพื่อรวบรวมของเหลวจากฝาหรือผนังจนถึงด้านล่าง หลีกเลี่ยงไม่ให้มีฟองอากาศระหว่างการทำงาน

ดูตารางด้านล่างสำหรับการตั้งค่าแผ่นที่แนะนำ:

เค้าโครงแผ่นประกอบด้วย: 1 กทช. (ไม่มี เทมเพลต การควบคุม) 1 เอ็นซีเอส (การควบคุมเชิงลบ สารละลาย), 6 STD (เส้นโค้งมาตรฐาน 6 ความเข้มข้นมาตรฐาน), 3 TS (ตัวอย่างทดสอบ) 3 ERC (การควบคุมการสกัดและการฟื้นตัว), 1 PCS (ตัวอย่างการควบคุมเชิงบวก)สามหลุมจำลองสำหรับแต่ละตัวอย่าง

7. แนวทางการติดตั้งเครื่องมือ PCR (วิธีการ 2 ขั้นตอน)

คำแนะนำต่อไปนี้ใช้ได้กับเครื่องมือ Thermo ABI 7500 qPCR เท่านั้น (ซอฟต์แวร์เวอร์ชัน 2.0) หากคุณใช้เครื่องมืออื่น โปรดดูคำแนะนำในการตั้งค่าเครื่องมือที่เกี่ยวข้อง

7.1 สร้างการทดลองใหม่ เลือกเทมเพลตการวัดเชิงปริมาณแบบสัมบูรณ์หรือแบบที่ผู้ใช้กำหนด

7.2 ในอินเทอร์เฟซ 'กำหนด' และบานหน้าต่าง 'เป้าหมาย' ให้เพิ่มเป้าหมายและตั้งชื่อเป็น FAM เลือกผู้รายงานเป็น 'FAM' และเลือกตัวดับเป็น 'ไม่มี'

7.3 ในบานหน้าต่าง 'ตัวอย่าง' ให้เพิ่มข้อมูลตัวอย่างทั้งหมดตามลำดับ จากนั้นเลือกหลุม เลือกเป้าหมายและตัวอย่างตามลำดับ ตั้งค่างานของ Vero มาตรฐาน DNA เป็นมาตรฐาน และกำหนดค่า 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3 (หน่วยความเข้มข้นของ DNA ในแต่ละหลุมคือ fg/μL) ในคอลัมน์จำนวน และตั้งชื่อหลุมเป็น STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6 ตามลำดับ ตั้งค่างานของ NTC เป็น NTC ตั้งค่า NCS, TS, ERC และพีซีเอส โดยไม่ทราบชื่อ และตั้งชื่อตามเค้าโครงแผ่นด้านบน จากนั้นคลิกถัดไป

7.4 ตั้งค่าโปรแกรมการขยาย: ตั้งค่าปริมาตรปฏิกิริยาเป็น 40 μL

8. การวิเคราะห์ผล qPCR

8.1 ระบบจะแสดงค่า Threshold ในแผง Amplification Plot ของ Analysis โดยอัตโนมัติ ค่า Threshold ที่ระบบกำหนดไว้บางครั้งอาจใกล้เคียงกับค่าพื้นฐานเกินไป ส่งผลให้ค่า Ct ระหว่างหลุมจำลองแตกต่างกันมาก คุณสามารถปรับค่า Threshold ด้วยตนเองไปยังตำแหน่งที่เหมาะสม และคลิก Analyze จากนั้น คุณสามารถตรวจสอบเบื้องต้นได้ว่าเส้นโค้งการขยายสัญญาณเป็นปกติหรือไม่ใน Multicomponent Plot

8.2 ในแท็บการวิเคราะห์ผลลัพธ์ ให้ตรวจสอบกราฟเส้นโค้งมาตรฐาน ตรวจสอบค่าสำหรับความชัน จุดตัดแกน Y และ R2 และประสิทธิภาพ สำหรับกราฟมาตรฐานปกติ R²>0.99; 90%≤Eff%≤110%

8.3 ใน 'ตารางมุมมอง' แผงในการวิเคราะห์ ความเข้มข้นของแต่ละตัวอย่างจะแสดงเป็นปริมาณ หน่วยเป็น fg/μL หน่วยสามารถแปลงเป็น pg/μL ได้ หรือ pg/mL ในรายงานการทดสอบ

คู่มือการใช้งาน