อีโคไล ชุดตรวจจับสารตกค้าง DNA ของเซลล์โฮสต์ใช้สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณของ E.coli การแยกดีเอ็นเอของเซลล์โฮสต์ในตัวอย่างกลาง ผลิตภัณฑ์กึ่งสำเร็จรูปและผลิตภัณฑ์สำเร็จรูปของผลิตภัณฑ์ทางชีวภาพต่างๆ

ชุดนี้ใช้โพรบเรืองแสง Taqman และวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ซึ่งมีขีดจำกัดการตรวจจับขั้นต่ำที่ระดับ fg และสามารถตรวจจับ E.coli ที่เหลือได้เฉพาะและรวดเร็ว ดีเอ็นเอของเซลล์ ชุดอุปกรณ์นี้ต้องใช้ร่วมกับชุดเตรียมตัวอย่างดีเอ็นเอที่เหลือ (Cat# 18461ES)

รายงานการตรวจสอบ

ข้อมูลจำเพาะ

ส่วนประกอบ

พื้นที่จัดเก็บ

ควรเก็บผลิตภัณฑ์นี้ไว้ที่ -25~-15℃ เป็นเวลา 2 ปี

ทั้ง 41308-A และ 41308-B ควรเก็บรักษาให้พ้นจากแสง

รุ่นเครื่องมือที่ใช้ได้

รวมถึงแต่ไม่จำกัดเพียง:

Bio-Rad: โมดูลออปติก CFX96

เทอร์โมไซแอนทิฟิค: ABI 7500; ABI Quant Studio 5

คำแนะนำ

1. อีโคไล การเจือจางมาตรฐาน DNA และการเตรียมเส้นโค้งมาตรฐาน

อีโคไล การควบคุม DNA ได้รับการเจือจางแบบไล่ระดับโดยใช้บัฟเฟอร์เจือจาง DNA ที่ให้มาในชุด^-และการเจือจาง

ความเข้มข้นคือ 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL

ดูคำแนะนำโดยละเอียดด้านล่าง:

• ละลายบัฟเฟอร์ควบคุม coliDNA และเจือจาง DNA บนน้ำแข็ง หลังจากละลายหมดแล้ว ให้ปั่นเบาๆ เพื่อผสมให้เข้ากัน แล้วปั่นด้วยความเร็วต่ำเป็นเวลา 10 วินาที
• นำหลอดทดลองขนาด 1.5 มล. ที่สะอาด จำนวน 6 หลอด ที่มีเครื่องหมาย Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 และ Std5 ออก
• เติมบัฟเฟอร์เจือจาง DNA 90 μL และตัวควบคุม coliDNA 10 μL ลงในหลอดไมโครฟิวจ์ 1.5 มล. ที่มีฉลาก Std0 ได้แก่ เจือจางเป็น 3 ng/μL ผสมแล้วปั่นเป็นเวลา 10 วินาที บรรจุมาตรฐาน DNA ที่เจือจางแล้ว และสามารถเก็บไว้ได้ในระยะสั้น (ไม่เกิน 3 เดือน) ที่อุณหภูมิ -25~-15℃^-.โปรดหลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ
• เติมบัฟเฟอร์เจือจาง DNA 90 μL ลงในหลอดอื่น^-จากนั้นทำตามขั้นตอนด้านล่างสำหรับการเจือจางแบบต่อเนื่อง^--

ตารางที่ 1 การเจือจางแบบไล่ระดับมาตรฐาน

^-จำเป็นต้องมีหลุมจำลองสามหลุมสำหรับความเข้มข้นแต่ละแบบ ช่วงการตรวจจับคือ 30 fg/μL~300pg/μL และสามารถขยายช่วงดังกล่าวได้

^-เพื่อลดจำนวนครั้งของการแช่แข็ง-ละลายซ้ำและหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน ขอแนะนำให้จัดเก็บตัวควบคุม DNA ในส่วนย่อยที่อุณหภูมิ -25~-15℃ เป็นครั้งแรก

^-เมื่อละลายแล้ว สามารถเก็บบัฟเฟอร์เจือจาง DNA ไว้ที่อุณหภูมิ 2-8°C ได้นาน 7 วัน หากไม่ได้ใช้เป็นเวลานาน โปรดเก็บที่อุณหภูมิ -25~-15℃

^-ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเทมเพลตผสมกันหมด เขย่าส่วนผสมเบาๆ เป็นเวลา 15 วินาทีถึง 1 นาทีสำหรับการเจือจางในแต่ละระดับ

2. การเตรียมการควบคุมการสกัดและการฟื้นฟู (ERC)

กำหนดความเข้มข้นของ DNA ของ E.coli ใน ERC ตามต้องการ (ตัวอย่าง ERC เตรียมโดยใช้ DNA ของ E.coli 30 pg เป็นตัวอย่าง) ดังนี้

• เติมตัวอย่างทดสอบ 100 μL ลงในหลอด 1.5 มล. ที่สะอาด จากนั้นเติมมาตรฐาน DNA E.coli 3pg/μL (Std3) 10 μL และผสมให้เข้ากัน โดยทำเครื่องหมายเป็น ERC
• ดำเนินการสกัด DNA จากตัวอย่าง ERC ร่วมกับตัวอย่างทดสอบเพื่อเตรียมตัวอย่าง ERC ที่บริสุทธิ์

3. การเตรียมสารละลายควบคุมเชิงลบ (NCS)

ตั้งค่าการควบคุมเชิงลบในการทดลอง ขั้นตอนการดำเนินการเฉพาะมีดังนี้:

1) เติมเมทริกซ์ตัวอย่าง 100 μL (หรือบัฟเฟอร์เจือจาง DNA) ลงในหลอดขนาด 1.5 มล. ที่สะอาด จากนั้นทำเครื่องหมายเป็น NCS

2) ดำเนินการสกัด DNA จากตัวอย่าง NCS ร่วมกับตัวอย่างทดสอบเพื่อเตรียมตัวอย่าง NCS ที่บริสุทธิ์

4. การจัดเตรียมการควบคุมเทมเพลต (NTC)

ตั้งค่าการควบคุมแบบไม่มีเทมเพลตในการทดลอง ขั้นตอนการดำเนินการเฉพาะมีดังนี้:

1) NTC ไม่ต้องการการเตรียมตัวอย่างล่วงหน้า และสามารถกำหนดค่าได้ในขั้นตอนการตรวจจับ qPCR ของ DNA ที่เหลือ

2) ตัวอย่าง NTC ในแต่ละหลอดทดลองหรือหลุมคือ 20 μL Mix (เช่น 15 μL E.coli qPCR Mix + 5 μL E.coli Primer&probe Mix) + 10 μL DNA Dilution Buffer ขอแนะนำให้กำหนดค่าหลุมจำลองสามหลุม

5. ระบบปฏิกิริยา PCR

ตารางที่ 2 ระบบปฏิกิริยา

^-คำนวณปริมาตรปฏิกิริยา PCR ทั้งหมดตามจำนวนปฏิกิริยา: qPCR Mix =(จำนวนปฏิกิริยา+2) × (15+5) μL (รวมการสูญเสียของหลุมปฏิกิริยาสองหลุม) แนะนำให้ทำซ้ำมากกว่าสามครั้งสำหรับแต่ละตัวอย่างในการทดลอง

^-หลังจากปิดฝาหลอดหรือปิดผนึกแผ่นแล้ว ให้ปั่นหลอดปฏิกิริยาหรือแผ่นด้วยความเร็วต่ำเป็นเวลา 10 วินาที หลังจากเขย่าและผสมอย่างเพียงพอเป็นเวลา 5 วินาที ให้ปั่นซ้ำเพื่อรวบรวมของเหลวจากฝาหรือผนังจนถึงด้านล่าง หลีกเลี่ยงไม่ให้มีฟองอากาศระหว่างการทำงาน

ดูตารางด้านล่างสำหรับการตั้งค่าแผ่นที่แนะนำ:

ตารางที่ 3 คอมพิวเตอร์บนกระดานอ้างอิง

เค้าโครงแผ่นประกอบด้วย: 5 Std (กราฟมาตรฐานของความเข้มข้นมาตรฐาน 5 รายการ), 1 NTC (ไม่มีการควบคุมเทมเพลต), 1 NCS (สารละลายควบคุมเชิงลบ), 3 TS (ตัวอย่างทดสอบ), 3 ERC (การควบคุมการกู้คืนการสกัด)สามหลุมจำลองสำหรับแต่ละตัวอย่าง

6. การตั้งค่า แนวทางการใช้เครื่องมือ PCR(วิธีการ 2 ขั้นตอน) （เช่น เครื่องมือ Thermo ABI 7500 qPCR ซอฟต์แวร์เวอร์ชัน 2.0）

คำแนะนำต่อไปนี้ใช้ได้กับเครื่องมือ Thermo ABI 7500 qPCR (ซอฟต์แวร์เวอร์ชัน 2.0) เท่านั้น หากคุณใช้เครื่องมืออื่น โปรดดูคำแนะนำในการตั้งค่าในคู่มือเครื่องมือที่เกี่ยวข้อง

1) สร้างการทดลองใหม่ เลือกเทมเพลตการวัดเชิงปริมาณแบบสัมบูรณ์หรือแบบที่ผู้ใช้กำหนด

2) สร้างโพรบตรวจจับ 1 ตัว ชื่อ "E.coli-DNA" เลือกฟลูออโรโฟร์รีพอร์เตอร์เป็น "FAM" และดับฟลูออโรโฟร์เป็น "None" ฟลูออโรฟอเรนซ์อ้างอิงคือ "ROX" (ฟลูออโรฟอเรนซ์อ้างอิงอาจขึ้นอยู่กับแบบจำลองเครื่องมือ เป็นต้น เลือกว่าคุณต้องการเพิ่มหรือไม่)

3) ในบานหน้าต่าง 'ตัวอย่าง' ให้เพิ่มข้อมูลตัวอย่างทั้งหมดตามลำดับ จากนั้นเลือกหลุม เลือกเป้าหมายและตัวอย่างตามลำดับ ตั้งค่างานของ E.coli มาตรฐาน DNA เป็นมาตรฐาน และกำหนดค่า 300000, 30000, 3000, 300, 30, 30 (หน่วยความเข้มข้นของ DNA ในแต่ละหลุมคือ fg/μL) ในคอลัมน์ Quantity และตั้งชื่อหลุมเป็น Std 1, มาตรฐาน 2, สตด 3, สตด 4, สตด. 5. ตั้งค่างานของ NTC เป็น NTC ตั้งค่า NCS, TS และ ERC โดยไม่ทราบชื่อ และตั้งชื่อตามเค้าโครงแผ่นด้านบน จากนั้นคลิกถัดไป

4) ตั้งค่าโปรแกรมการขยาย: ตั้งค่าปริมาตรปฏิกิริยาเป็น 30 μL

ตารางที่ 4 ขั้นตอนการขยาย

7. การวิเคราะห์ผล qPCR

1) ระบบจะแสดงค่า Threshold ในแผง Amplification Plot ของ Analysis โดยอัตโนมัติ ค่า Threshold ที่ระบบกำหนดไว้บางครั้งอาจใกล้เคียงกับค่าพื้นฐานเกินไป ส่งผลให้ค่า Ct ระหว่างหลุมจำลองแตกต่างกันมาก คุณสามารถปรับค่า Threshold ด้วยตนเองไปยังตำแหน่งที่เหมาะสมและคลิก Analyze จากนั้นคุณสามารถตรวจดูเบื้องต้นว่าเส้นโค้งการขยายสัญญาณเป็นปกติหรือไม่ใน Multicomponent Plot

2) ในแท็บการวิเคราะห์ผลลัพธ์ ให้ตรวจสอบกราฟเส้นโค้งมาตรฐาน ตรวจสอบค่าสำหรับ R², ประสิทธิภาพ, ความลาดชัน และจุดตัดแกน Y สำหรับเส้นโค้งมาตรฐานปกติ R²>0.99 90% ≤Eff% ≤110%, -3.6≤ความชัน≤-3.1

3) ในบานหน้าต่าง 'ดูตารางหลุม' ในการวิเคราะห์ ความเข้มข้นของแต่ละตัวอย่างจะแสดงเป็นปริมาณ ซึ่งมีหน่วยเป็น fg/μL โดยสามารถแปลงหน่วยได้ในรายงานการวิเคราะห์

4) การตั้งค่าพารามิเตอร์ของการวิเคราะห์ผลจำเป็นต้องขึ้นอยู่กับรุ่นเฉพาะและเวอร์ชันของซอฟต์แวร์ที่ใช้ และโดยทั่วไปเครื่องมือสามารถตีความได้โดยอัตโนมัติ

5) คำนวณอัตราการฟื้นตัวของค่าสไปค์โดยอิงจากผลการทดสอบ TS ของตัวอย่างที่ต้องการวัดและค่า ERC ของการกู้คืนค่าสไปค์ของตัวอย่าง โดยอัตราการฟื้นตัวของค่าสไปค์จะต้องอยู่ระหว่าง 50%~150%สูตรมิเตอร์อัตราการฟื้นตัวแบบสไปค์: การกู้คืน (%) = {Sample spiked assay (eg.pg/μL) - Sample assay (eg.pg/μL)} x ปริมาตรการชะออก (μL) / ค่าเชิงทฤษฎีของปริมาณการเติม DNA (เช่น pg) x 100%

6) ค่า Ct ของ NCS ควบคุมเชิงลบควรมากกว่าค่าเฉลี่ยของ Ct ความเข้มข้นต่ำสุดของมาตรฐาน

• เทมเพลตควบคุม NTC แบบฟรีควรไม่ถูกกำหนดหรือค่า Ct ≥3

หมายเหตุ

1. ผลิตภัณฑ์นี้ใช้เพื่อการวิจัยเท่านั้น
2. เพื่อความปลอดภัยของคุณ โปรดปฏิบัติงานโดยสวมเสื้อคลุมแล็บและถุงมือแบบใช้แล้วทิ้ง

3. โปรดอ่านคู่มือนี้อย่างละเอียดก่อนใช้สารเคมีนี้ และการทดลองควรได้มาตรฐาน รวมถึงการจัดการตัวอย่าง การเตรียมระบบปฏิกิริยา และการเติมตัวอย่าง

4. ตรวจสอบให้แน่ใจว่าส่วนประกอบแต่ละชิ้นถูกปั่นด้วยความเร็วต่ำและปั่นด้วยความเร็วต่ำก่อนใช้งาน

คู่มือ