ชุดทดสอบชนิดออกซิเจนที่มีปฏิกิริยาใช้รีเอเจนต์ที่ซึมผ่านเซลล์ได้ 2',7'–dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) เพื่อประเมินชนิดออกซิเจนที่มีปฏิกิริยาในตัวอย่างเซลล์ที่มีชีวิตในเชิงปริมาณ DCFDA ที่ไม่เรืองแสงและชอบไขมันสามารถผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ได้อย่างง่ายดายผ่านการแพร่กระจายแบบพาสซีฟตามด้วยดีอะเซทิลเลชัน ผลิตภัณฑ์ที่ถูกดีอะไซเลชันคือ 2',7'-dichlorofluorescein (DCHF) ที่ไวต่อสารออกซิแดนต์ DCHF จะถูกออกซิไดซ์ในภายหลังโดย ROS เพื่อสร้าง DCF DCF เรืองแสงได้สูงและตรวจจับได้ด้วยสเปกโตรสโคปีฟลูออเรสเซนต์หรือโฟลว์ไซโตเมทรีด้วยการกระตุ้น/การปล่อยที่ 480 นาโนเมตร/525 นาโนเมตร Rosup ซึ่งเป็นส่วนผสมของสารประกอบ เป็นตัวเหนี่ยวนำ ROS และสามารถใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวกได้

ส่วนประกอบของผลิตภัณฑ์

การขนส่งและการเก็บรักษา

ชุดนี้มาพร้อมกับถุงน้ำแข็ง เก็บที่อุณหภูมิ -20°C โดยไม่ต้องเปิดแสงเป็นเวลา 1 ปี หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ

วิธีการใช้งาน

1. การเตรียมสารเคมี
สารละลาย DCFH-DA: ปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็วต่ำสักครู่ก่อนเปิด เตรียมสารละลาย DCFH-DA ที่ใช้งานได้โดยการเจือจาง DCFH-DA 10 มิลลิโมลาร์ในตัวกลางที่ปราศจากซีรั่มเพื่อให้ได้ความเข้มข้นขั้นสุดท้าย 10 ไมโครโมลาร์
[หมายเหตุ]: DCFH-DA สามารถเจือจางในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่มีฟีนอลเรดได้เช่นกัน ให้ใช้สารละลาย DCFH-DA ที่เตรียมขึ้นใหม่ ไม่แนะนำให้เก็บ DCFH-DA ที่เจือจางไว้เป็นเวลานาน ความเข้มข้นที่แน่นอนของ DCFH-DA ที่ต้องการจะขึ้นอยู่กับสายพันธุ์เซลล์ที่ใช้ แต่ช่วงเริ่มต้นโดยทั่วไปจะอยู่ที่ 10-50 μM สำหรับเซลล์บางชนิด หากการเรืองแสงของตัวควบคุมเชิงลบ (โดยไม่มีโพรบ DCFH-DA) รุนแรงมาก ให้เจือจาง DCFH-DA ลงเหลือ 2-5 μM และลดระยะเวลาการบ่มเพาะ อย่างเหมาะสม.
สารละลาย Rosup: เตรียมสารละลาย Rosup 100 µM สำหรับการออกฤทธิ์โดยเจือจางสารละลาย Rosup 100 mM ในตัวกลางที่ปราศจากซีรั่ม โดยทั่วไป การบ่มด้วย Rosup ที่อุณหภูมิ 37 ℃ เป็นเวลา 30 นาทีถึง 4 ชั่วโมงในที่มืดสามารถเพิ่ม ROS ได้อย่างมาก
[หมายเหตุ]: ระยะเวลาในการบ่มเพาะของ Rosup จะขึ้นอยู่กับความไวของเซลล์ไลน์ ตัวอย่างเช่น 30 นาทีสำหรับ Hela และ 1.5 ชั่วโมงสำหรับ MRC5 หากไม่พบการเพิ่มขึ้นของ ROS ภายใน 30 นาที เวลาในการเหนี่ยวนำหรือความเข้มข้นอาจเพิ่มขึ้นตามความเหมาะสม หาก ROS เพิ่มขึ้นเร็วเกินไป เวลาในการเหนี่ยวนำหรือความเข้มข้นอาจลดลงตามความเหมาะสม
ยา: เตรียมยาที่ต้องการในสื่อสมบูรณ์ด้วย FBS 10% หรือสารละลายอื่นที่เหมาะสมตามความเข้มข้นที่ต้องการ
2. โปรโตคอลที่แนะนำสำหรับเซลล์ที่ยึดเกาะ
ก) การเตรียมเซลล์: เพาะเซลล์ที่มีการยึดเกาะในอาหารเลี้ยงเซลล์มาตรฐานหนึ่งวันก่อนการทดลอง เพื่อให้เซลล์มีการประสานกันถึง 70% ในเวลาที่ทำการทดลอง
ข) การเหนี่ยวนำยา: นำตัวกลางออก เคลือบแต่ละหลุมด้วยยาเจือจางที่เตรียมไว้แล้วโดยไม่มีซีรั่ม แล้วฟักเป็นเวลาที่ต้องการที่อุณหภูมิ 37°C ในที่มืด
ค) (ทางเลือก) การควบคุมเชิงบวก: วางบ่อควบคุมเชิงบวกทับด้วยสารละลาย Rosup ที่เตรียมไว้ก่อนหน้านี้ และฟักเป็นเวลาที่ต้องการที่อุณหภูมิ 37°C ในที่มืด
[หมายเหตุ]: สำหรับเซลล์ที่มีระยะเวลาการกระตุ้นสั้น (โดยปกติภายใน 2 ชั่วโมง) สามารถโหลดโพรบก่อน จากนั้นจึงเพิ่ม Roup หรือยาที่ต้องการได้
ง) การโหลดโพรบ ROS: ถอดตัวกลางทั้งหมดออกและล้างเซลล์ด้วยตัวกลางที่ไม่มีซีรั่ม 1-2 ครั้ง ทับแต่ละหลุมด้วยสารละลาย DCFH-DA ที่เตรียมไว้แล้ว ฟักที่อุณหภูมิ 37℃ เป็นเวลา 30 นาทีในที่มืด
ง) ถอดตัวกลางออก และล้างเซลล์ 1-2 ครั้งด้วยตัวกลางที่ไม่มีซีรั่มเพื่อกำจัด DCFH-DA ที่เป็นอิสระ
3. โปรโตคอลที่แนะนำสำหรับเซลล์แขวนลอย
ก) การเตรียมเซลล์: เพาะเซลล์แขวนลอยให้ได้ประมาณ 1.5 × 105 เซลล์ต่อหลุมในวันที่ทำการทดลอง
ข) การกระตุ้นยา: รวบรวมเซลล์ในหลอดกรวยโดยการปั่นเหวี่ยง แล้วนำไปแขวนลอยใหม่ในยาเจือจางปราศจากซีรั่มที่เตรียมไว้ล่วงหน้าในปริมาณที่เหมาะสม จากนั้นฟักที่อุณหภูมิ 37°C ในที่มืดตามเวลาที่ต้องการ
ค) (ทางเลือก) การควบคุมเชิงบวก: แขวนลอยเซลล์ควบคุมเชิงบวกอีกครั้งด้วยสารละลาย Rosup ที่เตรียมไว้ก่อนหน้านี้ และฟักเป็นเวลาที่ต้องการที่อุณหภูมิ 37°C ในที่มืด
ง) การโหลดโพรบ ROS: เก็บในหลอดใหม่และล้างเซลล์ด้วยการปั่นเหวี่ยงสองครั้งใน PBS แขวนเซลล์ใหม่ด้วยสารละลาย DCFH-DA ที่เตรียมไว้ก่อนหน้านี้ โดยมีความหนาแน่นของเซลล์ที่ 1×106-2×107/mL จากนั้นฟักที่อุณหภูมิ 37℃ เป็นเวลา 30 นาทีในที่มืด พลิกหลอดทุกๆ 3-5 นาทีเพื่อให้แน่ใจว่าโพรบและเซลล์สัมผัสกันเต็มที่
[หมายเหตุ]: ควรปรับความหนาแน่นของเซลล์ตามวิธีการตรวจจับที่ตามมา ตัวอย่างเช่น สำหรับการตรวจวัดแบบไซโตเมทรีแบบไหล จำนวนเซลล์ในหลอดเดียวไม่ควรน้อยกว่า 104/มล. หรือมากกว่า 106/มล.
ง) เก็บและล้างเซลล์โดยการปั่นสองครั้งด้วยตัวกลางที่ปราศจากซีรั่มเพื่อกำจัด DCFH-DA ที่เป็นอิสระ
4. การตรวจจับฟลูออเรสเซนต์และการวิเคราะห์ข้อมูล
การวัดด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์: ทำการส่องกล้องจุลทรรศน์เซลล์สดด้วยชุดฟิลเตอร์ที่เหมาะสำหรับฟลูออเรสซีน (FITC) โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ ให้คะแนนความสว่างของเซลล์ด้วยสายตาและเปรียบเทียบระหว่างเซลล์ควบคุมและเซลล์ตัวอย่าง หรือใช้การวิเคราะห์ภาพเพื่อเปรียบเทียบสัญญาณระหว่างภาพถ่ายดิจิทัลของเซลล์
การวัดไซโตเมทรีแบบไหล: ควรเก็บเซลล์ที่ยึดเกาะด้วยทริปซินเพื่อเตรียมเซลล์แขวนลอยเดี่ยว สำหรับเซลล์แขวนลอย ควรเก็บเซลล์โดยตรง โดยในอุดมคติ ควรวิเคราะห์เซลล์ 10,000 เซลล์ต่อสภาวะการทดลอง เซลล์ไม่ควรมีความหนาแน่นมากเกินไปในระหว่างการทดลอง (<1 ×106 เซลล์/มล.) แยกเศษซากและแยกประชากรเซลล์ที่สนใจโดยใช้การจำกัด ใช้ความเข้มของฟลูออเรสเซนต์เฉลี่ย กำหนดการเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัวระหว่างตัวอย่างควบคุมและตัวอย่างที่ผ่านการบำบัดด้วย Ex/Em = 480/525 นาโนเมตร
การวัดไมโครเพลทเรืองแสง: วัดเพลทบนเครื่องอ่านเพลทเรืองแสงทันทีที่ Ex/Em = 480/525 นาโนเมตรในโหมดจุดสิ้นสุดเมื่อมีตัวกลาง ลบค่าการอ่านว่างออกจากการวัดทั้งหมด และกำหนดการเปลี่ยนแปลงการพับจากการควบคุมการวิเคราะห์

ข้อควรระวัง

1. ล้างเซลล์หลังจากการฟักด้วย DCFH-DA เพื่อลดสัญญาณรบกวนพื้นหลัง
2. แนะนำให้วัดค่าฟลูออเรสเซนต์โดยเร็วที่สุดหลังการฟักเพื่อหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดที่อาจเกิดขึ้น
3. เพื่อความปลอดภัยและสุขภาพของคุณ โปรดสวมเสื้อคลุมแล็บและถุงมือแบบใช้แล้วทิ้งในระหว่างการผ่าตัด
4. เพื่อการวิจัยเท่านั้น!