Puromycin เป็นยาปฏิชีวนะประเภทอะมิโนไกลโคไซด์ที่ผลิตขึ้นจากการหมักและการเผาผลาญของ Streptomyces alboniger ซึ่งฆ่าแบคทีเรียแกรมบวก เซลล์สัตว์และแมลงต่างๆ ด้วยการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีน Puromycin มีประสิทธิภาพต่อเชื้อ E. coli ในบางกรณี กลไกการทำงานมีดังนี้ พูโรไมซิน เป็นอะนาล็อกของปลาย 3´ ของโมเลกุลอะมิโนอิล-TrNA ซึ่งสามารถจับกับตำแหน่ง A ของไรโบโซมและรวมเข้ากับโซ่เปปไทด์ที่ขยายออกได้ หลังจากที่พิวโรไมซินจับกับตำแหน่ง A แล้ว จะไม่มีส่วนร่วมในปฏิกิริยาใดๆ ตามมา ส่งผลให้การสังเคราะห์โปรตีนสิ้นสุดลงก่อนกำหนดและปล่อยโพลีเปปไทด์ที่ยังไม่โตเต็มที่ซึ่งประกอบด้วยพิวโรไมซินที่ปลาย C

ยีน pac ที่พบในสายพันธุ์ Streptomyces alboniger ที่ผลิต puromycin เข้ารหัส puromycin N-acetyltransferase (PAC) ที่ทำให้ต้านทาน puromycin คุณสมบัตินี้ใช้กันอย่างแพร่หลายในปัจจุบันเพื่อคัดกรองสายเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่ถ่ายโอนยีน pac อย่างเสถียร

การประยุกต์ใช้พูโรไมซินโดยทั่วไปในการคัดเลือกการถ่ายโอนยีนที่เสถียรนั้นเกี่ยวข้องกับลักษณะของเวกเตอร์เลนติไวรัส ปัจจุบันเวกเตอร์เลนติไวรัสเชิงพาณิชย์ส่วนใหญ่มียีน PAC ในบางกรณีเฉพาะ พูโรไมซินยังสามารถใช้เพื่อคัดกรองการเปลี่ยนแปลงของสายพันธุ์ E. coli ที่มีพลาสมิดยีน PAC ได้อีกด้วย

ผลิตภัณฑ์นี้เหมาะสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ ความเข้มข้นในการทำงานทั่วไปคือ 1-10 µg/mL

นอกจากนี้, Yeasen บริษัทนี้ยังจัดหา puromycin (หมายเลขสินค้า 60209ES) ในรูปแบบสารละลาย ซึ่งอยู่ในสถานะที่แตกต่างกันแต่มีหน้าที่เหมือนกัน

คุณสมบัติ

ความบริสุทธิ์98%

แอปพลิเคชั่น

เหมาะสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์

สสายพันธุ์เซลล์ที่ได้รับการถ่ายยีนแบบเสถียรเฉพาะของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีพลาสมิดที่มียีน PAC

หน้าจอ เดอะ สายพันธุ์ E. coli ที่เปลี่ยนแปลงซึ่งมีพลาสมิดยีน pac

ข้อมูลจำเพาะ

ส่วนประกอบ

การขนส่งและการเก็บรักษา

การ พียูโรไมซิน งไอไฮโดรคลอไรด์ ผลิตภัณฑ์ควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -15℃ ~ -25℃ สำหรับ 2 ปี.

คำแนะนำ

1. ความเข้มข้นในการทำงานที่แนะนำ

เซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม: 1-10 μg/mL ความเข้มข้นที่เหมาะสมจะต้องกำหนดโดยใช้เส้นโค้งการฆ่า

Escherichia coli: ใช้ LB agar medium เพื่อคัดกรอง Escherichia coli ที่ถูกเปลี่ยนแปลงอย่างเสถียรด้วยยีน pac ที่ความเข้มข้น 125 μกรัม/มิลลิลิตร

บันทึก- การคัดกรองสายพันธุ์ E. coli ที่เสถียรโดยใช้พิวโรไมซินต้องปรับ pH อย่างแม่นยำ

ความเข้มข้นที่แนะนำของ พูโรไมซิน ไฮโดรคลอไรด์

2. วิธีการละลาย

ละลายพูโรไมซินในน้ำกลั่นเพื่อเตรียมสารละลายสต็อก 50 มก./มล. หลังจากฆ่าเชื้อด้วยการกรองผ่าน 0.22 μเมมเบรนกรอง m แบ่งส่วนและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -25 ถึง -15℃หรืออาจละลายในเมทานอลเพื่อเตรียมสารละลายจัดเก็บ 10 มก./มล.

3. การกำหนด พูโรไมซิน เส้นโค้งแห่งการฆ่า (ยกตัวอย่างการถ่ายยีน shRNA หรือการถ่ายโอนยีนเลนติไวรัส)

ความเข้มข้นในการคัดกรองที่มีประสิทธิภาพของ พูโรไมซิน เกี่ยวข้องกับชนิดของเซลล์ สถานะการเจริญเติบโต ความหนาแน่นของเซลล์ การเผาผลาญของเซลล์ และตำแหน่งของวงจรเซลล์ เพื่อคัดกรองเซลล์ shRNA ที่แสดงออกอย่างเสถียร จำเป็นต้องกำหนดความเข้มข้นขั้นต่ำของพูโรไมซินที่สามารถฆ่าเซลล์ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีน/ถ่ายยีน ขอแนะนำว่าลูกค้าที่กำลังทำการทดลองเป็นครั้งแรกจะต้องสร้างเส้นโค้งการฆ่าที่เหมาะสมกับระบบการทดลองของตนเอง

1) วันที่ 1: แผ่น 24 หลุมถูกชุบที่ความหนาแน่น 5-8เซลล์ 104 เซลล์ต่อหลุม และจำนวนหลุมที่เพียงพอถูกเพาะไว้สำหรับการทดลองไล่ระดับในภายหลัง เซลล์ถูกฟักค้างคืนที่อุณหภูมิ 37℃-

2) วันที่ 2: ก) เตรียมอาหารคัดกรอง: อาหารสดที่มีสารพิวโรไมซินในความเข้มข้นต่างๆ (เช่น 0-15 μg/mL อย่างน้อย 5 ระดับความชัน B) เปลี่ยนตัวกลางการคัดกรองที่เตรียมไว้ใหม่ในเซลล์หลังจากฟักค้างคืน จากนั้นฟักเซลล์ที่ 37℃-

3) วันที่ 4: เปลี่ยนด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อสดและสังเกตความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์

4) ขึ้นอยู่กับสภาวะการเจริญเติบโตของเซลล์ ให้เปลี่ยนเป็นอาหารคัดเลือกสดทุก ๆ 2-3 วัน

5) มีการตรวจสอบเซลล์ทุกวันเพื่อสังเกตอัตราของเซลล์ที่มีชีวิตเพื่อกำหนดความเข้มข้นต่ำสุดของยาที่มีประสิทธิผลในการฆ่าเซลล์ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีนหรือเซลล์ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีนทั้งหมดภายใน 4-6 วันนับจากเริ่มการคัดกรองด้วยยาปฏิชีวนะ

4. การคัดกรองเซลล์สายพันธุ์ที่ผ่านการถ่ายโอนยีนอย่างเสถียรในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม

หลังการถ่ายยีนพลาสมิดที่มียีน pac แล้ว เซลล์จะถูกขยายพันธุ์ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี puromycin เพื่อคัดเลือกทรานส์เฟกตันต์ที่มีเสถียรภาพ

1) 48 ชั่วโมงหลังการถ่ายยีน เซลล์ (ดั้งเดิมหรือเจือจาง) จะได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารสดที่มีสารพิวโรไมซินในความเข้มข้นที่เหมาะสม

หมายเหตุ: ยาปฏิชีวนะจะมีประสิทธิภาพสูงสุดเมื่อเซลล์กำลังแบ่งตัว หากเซลล์มีความหนาแน่นมากเกินไป ประสิทธิภาพของยาปฏิชีวนะจะลดลงอย่างมาก ควรเพาะเซลล์ให้มีความหนาแน่นไม่เกิน 25%

2) ถอดและเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี พูโรไมซิน ทุก 2-3 วัน

3) ประเมินเซลล์โฟคัสที่เกิดขึ้น 7 วันหลังการคัดกรอง อาจต้องใช้เวลาเพิ่มเติมอีกหนึ่งสัปดาห์หรือมากกว่านั้น ขึ้นอยู่กับสายเซลล์โฮสต์และประสิทธิภาพการคัดกรองการถ่ายโอนยีน

หมายเหตุ: สังเกตสถานะการเติบโตของเซลล์ทุกวัน การคัดกรองพูโรไมซินต้องใช้เวลาอย่างน้อย 48 ชั่วโมง และระยะเวลาการคัดกรองความเข้มข้นที่มีประสิทธิภาพของพูโรไมซินโดยทั่วไปคือ 3-10 วัน

4) ถ่ายโอนและวางโคลนที่ต้านทาน 5-10 โคลนลงในจานเพาะเชื้อขนาด 35 มม. และเพาะเลี้ยงต่อไปด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อเป็นเวลา 7 วัน การเพาะเลี้ยงเพื่อเสริมสมรรถนะนี้ใช้เพื่อเตรียมพร้อมสำหรับการทดลองพิษต่อเซลล์ในอนาคต-

เอกสาร:

เอกสารข้อมูลความปลอดภัย

60210_เอกสารความปลอดภัย_HB220421_EN.pdf

คู่มือการใช้งาน

60210_คู่มือ_HB250114_EN.pdf

การอ้างอิง & เอกสารอ้างอิง:

[1] Furge KA. et al., 2001 การยับยั้งการก่อมะเร็งและการแพร่กระจายที่เกิดจาก Ras ผ่านการยับยั้ง Met receptor tyrosine kinase PNAS 98:10722-7

[2] Díaz J. et al., 2014.Rab5 จำเป็นสำหรับเซลล์มะเร็งที่แพร่กระจายเพื่อการกระตุ้น การอพยพ และการบุกรุกของ Rac1 ที่เพิ่มขึ้นโดย Caveolin-1 J Cell Sci. 127:2401-6

[3] Rössger K. et al., 2013. การควบคุมความดันโลหิตสูงโดยอาศัยรางวัลโดยใช้อินเทอร์เฟซสังเคราะห์ระหว่างสมองกับโดปามีน PNAS, 110:18150-5

[4] Kamer I. et al., 2005. Proapoptotic BID เป็นตัวกระตุ้น ATM ในการตอบสนองต่อความเสียหายของ DNA Cell. 122:593-603

[5] Charnaux N. et al., 2005. RANTES (CCL5) กระตุ้นการหลั่งของ syndecan-1 (CD138) และ syndecan-4 จากเซลล์และรูปแบบ HeLa ที่เร็วขึ้นโดยขึ้นอยู่กับ CCR5

[6] Gao J, Zhao N, Knutson MD และคณะ โปรตีน Hemochromatosis ที่ถ่ายทอดทางพันธุกรรม HFE ยับยั้งการดูดซึมธาตุเหล็กผ่านการลดระดับ Zip14 ในเซลล์ HepG2 [J] วารสารเคมีชีวภาพ 2008, 283(31):21462-8

[7] Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M และคณะ คอมเพล็กซ์ TSC1-TSC2 จำเป็นต่อการกระตุ้น mTOR2[J] อย่างเหมาะสม ชีววิทยาโมเลกุลและเซลล์ 2008, 28(12):4104-4115

[8] Nasser MW, Datta J, Nuovo G และคณะ Nasser MW, Datta J, Nuovo G, Kutay H, Motiwala T, Majumder S, Wang B, Suster S, Jacob ST, Ghoshal K การควบคุมไมโครอาร์เอ็นเอ-1 (miR-1) ในมะเร็งปอด การยับยั้งคุณสมบัติการก่อมะเร็งของเซลล์มะเร็งปอดและความไวต่ออะพอพโทซิสที่เหนี่ยวนำโดย doxorubicin โดย miR-1 J Biol Chem 283: 33394-33405[J] วารสารเคมีชีวภาพ 2008, 283(48):33394-33405

(9) Paatero AO, Hilkka T, Happonen LJ และคณะ การรวม Bacteriophage Mu ในจีโนมของยีสต์และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม [J] การวิจัยกรดนิวคลีอิก, 2008, 36(22): e148-e148

[10] Zhang D และคณะ เส้นทาง cGAS-STING-PERK ที่ไม่ใช่แบบแผนช่วยอำนวยความสะดวกให้กับโปรแกรมการแปลที่สำคัญสำหรับภาวะชราและพังผืดของอวัยวะ Nat Cell Biol. 2022 พฤษภาคม;24(5):766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2 พฤษภาคม 2022 PMID: 35501370

[11] Lu T และคณะ CD73 ในเวสิเคิลนอกเซลล์ขนาดเล็กที่ได้จาก HNSCC กำหนดภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกซึ่งควบคุมโดยแมคโครฟาจในสภาพแวดล้อมจุลภาค J Extracell Vesicles 2022 พฤษภาคม;11(5): e12218 doi: 10.1002/jev2.12218 PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142

[12] เฉิน เอส และคณะการระบุโปรตีเอส 32 เฉพาะต่อยูบิควิตินเป็นออนโคยีนในกลีโอบลาสโตมาและกลไกพื้นฐาน Sci Rep. 2022 เม.ย. 19;12(1):6445 doi: 10.1038/s41598-022-09497-y PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837

[13] Han L และคณะ Uterus globulin associated protein 1 (UGRP1) binds podoplanin (PDPN) to promote a novel infection pathway during Streptococcus pneumoniae infection. Clin Transl Med. 2022 มิ.ย.;12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850. PMID: 35652821; PMCID: PMC9161880

[14] Sun Q และคณะ แกน MORTALIN-Ca2+ ขับเคลื่อนความต้านทานต่อริทูซิแมบโดยกำเนิดในมะเร็งต่อมน้ำเหลืองชนิดเซลล์ B ขนาดใหญ่แบบแพร่กระจาย Cancer Lett. 1 กรกฎาคม 2022; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 18 เมษายน 2022. PMID: 35447282