ซัลเฟต G418 หรือที่รู้จักกันในชื่อเจเนติซินซัลเฟต เป็นยาปฏิชีวนะอะมิโนไกลโคไซด์และมีโครงสร้างคล้ายกับเจนตาไมซินบี 1 โดยจะไปขัดขวางการสังเคราะห์โปรตีนโดยการจับกับไรโบโซม 80s และปิดกั้นขั้นตอนการยืดออก ซัลเฟต G418 เป็นพิษต่อเซลล์ทั้งโพรคาริโอตและยูคาริโอต รวมถึงแบคทีเรีย ยีสต์ เซลล์พืชชั้นสูงและเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ตลอดจนโปรโตซัวและหนอน ยีนต้านทาน (ส่วนใหญ่คือนีโอ) ซึ่งอยู่ในทรานสโพซอน Tn601 (903) หรือ Tn5 ได้มาจากแบคทีเรีย แต่สามารถแสดงออกได้ในเซลล์ยูคาริโอต ยีนต้านทานสามารถนำเข้าสู่เซลล์ได้โดยใช้เทคนิคการรวมยีนเพื่อให้ได้ความต้านทานของ G418 ซึ่งสามารถนำไปใช้ในการคัดกรองและรักษาการเพาะเลี้ยงเซลล์โพรคาริโอตหรือยูคาริโอตที่มียีนต้านทาน

ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม นีโอเข้ารหัสการแสดงออกของอะมิโนไกลโคไซด์ 3' -ฟอสโฟทรานสเฟอเรส (APH (3') II) หลังจากรวมเข้ากับจีโนมยูคาริโอต เอนไซม์นี้จะทำให้ยาปฏิชีวนะไม่ทำงานโดยปรับเปลี่ยนฟังก์ชันอะมิโนหรือไฮดรอกซิลของ G418 อย่างโคเวเลนต์และยับยั้งปฏิสัมพันธ์ระหว่างยาปฏิชีวนะกับไรโบโซม ทำให้เซลล์มีความต้านทาน G418 ในการคัดกรองการทดลองเซลล์สายพันธุ์เสถียร ควรสร้างกราฟการฆ่า (กราฟปริมาณ-การตอบสนอง) เพื่อกำหนดความเข้มข้นที่มีประสิทธิภาพขั้นต่ำในการฆ่าเซลล์ที่ไม่ดื้อยา

ในเซลล์พืช ความต้านทานสามารถเกิดขึ้นได้จากการถ่ายยีน nptII ที่ต้านทานพลาสมิดได้ ยีน nptII ยังเข้ารหัสอะมิโนไกลโคไซด์ฟอสโฟทรานสเฟอเรส ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่ทำให้ยาปฏิชีวนะหลายชนิดไม่ทำงาน รวมถึง G418, คาเนมัยซิน และพาโลไมซิน

คุณสมบัติ

ความบริสุทธิ์98%

การผลิตที่ได้มาตรฐาน โดยใช้โหมดการผลิตจำนวนมากแบบโรงงาน

ขอบเขตการใช้งานที่กว้างขวาง ซึ่งสามารถนำไปใช้ในสาขาชีววิทยาโมเลกุลและการวิจัยเชิงทดลองทางชีวเคมีของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

แพลตฟอร์มความร่วมมือครอบคลุมทั้ง

เพื่อให้มั่นใจถึงเสถียรภาพของคุณภาพผลิตภัณฑ์ ความแตกต่างระหว่างล็อตจะถูกควบคุมให้อยู่ภายใน 1%

แอปพลิเคชั่น

การคัดกรองเซลล์สายพันธุ์ที่ผ่านการถ่ายโอนยีนอย่างเสถียร

ข้อมูลจำเพาะ

ส่วนประกอบ

การขนส่งและการเก็บรักษา

การ G418 ซัลเฟต (เจเนติซิน) ผลิตภัณฑ์ควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -15℃ ~ -25℃ สำหรับ 3 ปี.

คำแนะนำ

1. การเตรียมสารละลายเก็บรักษา G418 (50 มก./มล. ความเข้มข้นที่ออกฤทธิ์)

1) การแปลงหน่วยกิจกรรม

การแปลงดำเนินการตามสูตรนี้: (1000/A0) ×A1=A2

A0: ค่าความแรงของ G418 แตกต่างกันไปในแต่ละล็อต โปรดดูรายงานคุณภาพในแต่ละล็อตหรือฉลากบนขวด

A1: ความเข้มข้นของสารออกฤทธิ์ G418 ที่คุณต้องการ

A2: ความเข้มข้นที่แท้จริงของ G418

ตัวอย่างเช่น หากค่ากิจกรรม G418 ของชุดคือ 750 U/mg และความเข้มข้นที่ออกฤทธิ์ของ G418 คือ 50 mg/mL ความเข้มข้นของผงจริงที่ต้องเตรียมคือ 1000/750×50 mg/mL = 66.67 mg/mL หากเตรียมสารละลายสำหรับเก็บรักษา G418 จำนวน 10 มล. (ความเข้มข้นที่ออกฤทธิ์ 50 mg/mL) ควรชั่งน้ำหนักผง 666.7 มก.

2) การฆ่าเชื้อและการเก็บรักษา

ชั่งน้ำหนักผงจริงที่ได้จากการแปลงข้างต้น และเติมน้ำดีไอออนที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว 10 มิลลิลิตร เพื่อละลายจนหมด

จุ่มเข็มกรองขนาด 0.22 μm ลงในน้ำที่ผ่านการดีไอออนไนซ์ฆ่าเชื้อ 5 มล. ก่อน แล้วจึงกรองเพื่อฆ่าเชื้อสารละลาย G418แบ่งสารละลาย G418 ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วออกเป็น 2 ส่วนและเก็บที่อุณหภูมิ -20℃

หมายเหตุ: ① ห้ามกรองสารละลายที่ขุ่น เนื่องจากสารละลายยังไม่ละลายหมด กระบวนการกรองจะทำให้สูญเสียยาและลดการทำงานของสารละลายสุดท้าย ② ไม่แนะนำให้ใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ สารละลายฟอสเฟต หรือตัวทำละลายอินทรีย์ในการเตรียมสารละลายสำหรับจัดเก็บ

2. ความเข้มข้นในการคัดกรองที่ใช้กันทั่วไป

โดยทั่วไป จำเป็นต้องใช้ G418 ในความเข้มข้นสูงในขั้นแรกเพื่อคัดกรองทรานสฟอร์เตอร์ และใช้ความเข้มข้นต่ำเพื่อรักษาการเพาะเลี้ยงไว้ สภาวะการเจริญเติบโต ประเภทของเซลล์ และปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อมอื่นๆ อาจส่งผลต่อปริมาณ G418 ที่มีประสิทธิภาพ ดังนั้นจึงขอแนะนำให้กำหนดความเข้มข้นที่เหมาะสมในการคัดกรองโดยใช้เส้นโค้งการฆ่าเชื้อ (เส้นโค้งปริมาณ-การตอบสนอง)

โดยทั่วไปช่วงการคัดกรองเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมคือ 200-2000 μg/mL เซลล์พืช: 10-100 μg/mL เซลล์ยีสต์: 500-1000 μg/mL

ข้อมูลการทดลองเซลล์สายพันธุ์

3. การจัดทำเส้นโค้งการฆ่า

หมายเหตุ: เพื่อคัดกรองเซลล์สายพันธุ์ที่มีการแสดงออกของโปรตีนเป้าหมายที่เสถียร จำเป็นต้องกำหนดความเข้มข้นขั้นต่ำของยาปฏิชีวนะที่สามารถฆ่าเซลล์โฮสต์ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีน ซึ่งสามารถทำได้โดยการสร้างกราฟการฆ่า (กราฟปริมาณ-การตอบสนอง) ควรเลือกความเข้มข้นอย่างน้อย 6 ระดับ G418 จะออกฤทธิ์มากที่สุดเมื่อทำการรักษาเซลล์ไมโทซิส ดังนั้นจำเป็นต้องเพาะเลี้ยงเซลล์เป็นระยะเวลาหนึ่งก่อนที่จะเติม G418

1) วันที่ 1: เซลล์ที่ยังไม่ได้เปลี่ยนรูปจะถูกวางบนแผ่นเพาะเลี้ยงที่เหมาะสม โดยมีความหนาแน่นของเซลล์ 20-25% ที่อุณหภูมิ 37℃ และเพาะเลี้ยงข้ามคืนใน CO₂-

หมายเหตุ: สำหรับเซลล์ที่ต้องการความหนาแน่นสูงกว่าเพื่อตรวจจับความมีชีวิต สามารถเพิ่มปริมาณการเพาะได้

2) ตั้งค่าความเข้มข้นของ G418 ให้อยู่ในช่วงที่เหมาะสมตามชนิดของเซลล์ เซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมสามารถตั้งค่าได้ที่ 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL

3) วันที่ 2: นำตัวกลางเก่าออกแล้วแทนที่ด้วยตัวกลางที่เตรียมไว้ใหม่ซึ่งมีความเข้มข้นของยาที่สอดคล้องกัน ทำขนานกันสามตัวสำหรับความเข้มข้นแต่ละแบบ

4) จากนั้นเปลี่ยนด้วยสื่อสดที่มี G418 ทุกๆ 3-4 วัน

5) การนับจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตจะดำเนินการเป็นรอบคงที่ (เช่น ทุกๆ 2 วัน) เพื่อกำหนดความเข้มข้นที่เหมาะสม เลือกความเข้มข้นขั้นต่ำที่จะฆ่าเซลล์ส่วนใหญ่ภายในจำนวนวันที่เหมาะสม (โดยปกติคือ 7-10 วัน) เป็นความเข้มข้นที่ใช้ในการคัดกรองเซลล์ทรานสเฟกชันที่เสถียร

4. การคัดกรองเซลล์ที่ผ่านการถ่ายโอนยีนที่มีเสถียรภาพ

1) 48 ชั่วโมงหลังการถ่ายยีน จะต้องใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ G418 ที่มีความเข้มข้นที่เหมาะสมสำหรับการเพาะเลี้ยงย่อย (การเพาะเลี้ยงย่อยโดยตรงหรือการเพาะเลี้ยงย่อยที่เจือจาง)

หมายเหตุ: เพื่อให้ได้ผลลัพธ์การคัดกรองที่ดี แนะนำให้เจือจางเซลล์ไม่เกิน 25%

2) เปลี่ยนสื่อคัดกรองที่มีตัวยาอยู่ทุก 3-4 วัน

3) วัดการสร้างกลุ่มเซลล์หลังจากทำการคัดกรองเป็นเวลา 7 วัน การสร้างกลุ่มเซลล์อาจใช้เวลาอีกหนึ่งสัปดาห์หรือมากกว่านั้น ขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์โฮสต์ การถ่ายโอนยีน และประสิทธิภาพของการคัดกรอง

4) คัดเลือกโคลนที่ต้านทานจำนวน 5-10 โคลน แล้วถ่ายโอนไปยังจานเพาะเลี้ยงเซลล์ขนาด 35 มม. และเพาะเลี้ยงด้วยอาหารคัดกรองที่ประกอบด้วยตัวยาเป็นเวลา 7 วัน

5) เปลี่ยนด้วยสื่อปกติ

เอกสาร:

เอกสารข้อมูลความปลอดภัย

60220_เอกสารความปลอดภัย_HB220421_EN.pdf

คู่มือการใช้งาน

60220_คู่มือ_HB250115_EN.pdf

ตัวเลข

รูปที่ 1-การทดสอบความคงตัวและการตรวจสอบความเข้มข้นที่มีประสิทธิภาพของจีโนไมซินระหว่างชุดที่แตกต่างกัน

สายพันธุ์ทดลอง: อี.โคไล

G69 และ G99 เป็นสองรุ่นที่แตกต่างกัน

ความเข้มข้นของการใช้จีโนไมซินถูกกำหนดไว้ที่ 8 มก./ล. 12 มก./ล. และ 16 มก./ล. ตามลำดับ และความเข้มข้นขั้นต่ำที่มีประสิทธิภาพถูกกำหนดไว้ที่ 16 มก./ล. ซึ่งยับยั้งการเติบโตของแบคทีเรียต่างๆ ได้อย่างสมบูรณ์แบบ ประสิทธิภาพของทั้งสองชุดมีความสม่ำเสมอ