Sevgili dostlar, protein immünoblotlama sırasında çeşitli Yükleme Kontrolü ve Epitop Etiketleme Antikorlarıyla karşılaştığınızda kendinizi kaybolmuş hissediyor musunuz? Yükleme Kontrolü proteinler organizmalardaki ev idaresi genleri tarafından kodlanır ve birden fazla dokuda stabil bir şekilde ifade edilir. İmmünolojik deneylerin normal şekilde ilerleyip ilerlemediğini doğrulamak ve protein ifadesi için yarı-kantitatif bir tespit standardı olarak kullanılırlar. Peki, yükleme kontrol antikorlarını doğru bir şekilde nasıl seçersiniz? Aşağıdaki noktalara başvurabilirsiniz.
I. Örnek Tür Kökeni
- Memeli doku veya hücrelerinden alınan örnekler için genellikle β-aktin, α-tubulin, GAPDH, Lamin-B, Histon H3, Na+/K+-ATPaz seçilir.
- Bitkisel kaynaklı numuneler için genellikle bitki aktin, Rubisco vb. seçilir.
- Daha az araştırmaya sahip diğer örnekler için, ilgili literatüre veya veri tabanlarına danışarak uygun proteini dahili referans olarak seçin.
Hedef proteinin moleküler ağırlığının yükleme kontrolünden farklı olduğundan emin olun Tespit sırasında girişimi önlemek için 5KDa'dan daha fazla. Örneğin, hedef protein 40KDa ise, yükleme kontrolü olarak β-aktin (42KDa) seçmek uygun değildir. Yükleme kontrolü olarak GAPDH (36KDa) veya β-tubulin (55KDa) kullanmayı düşünün.
III. Dahili Referans Proteininin İfade Alanı
Not: Aşağıdaki durumlardan kaçının: yükleme kontrol antikorları
| Hücre altı lokalizasyonu | Yükleme Kontrol Proteini | Moleküler Ağırlık (KDa) | Notlar |
| Sitoplazma, Tüm Hücre | β-aktin | 42 | Nükleer ekstraktlar için uygun değildir. β-aktin, kromatin yeniden şekillendirme komplekslerinin bir bileşenidir; araştırma denekleri arasında önemli yaş farklılıklarının olduğu durumlar için uygun olmayabilir. |
| α-Tübülin | 55 | Araştırma denekleri arasında önemli yaş farklılıklarının olduğu durumlar için uygun değildir. Tubulin ekspresyonu antimikrobiyal ve antimitotik ilaçlarla değişir, bu nedenle antikanser ve antifungal ilaçlar eklendiğinde uygun değildir. | |
| β-Tübülin | 55 | ||
| GAPDH | 36 | Hücre hipoksisi GAPDH ekspresyonunun artmasına neden olacağından oksijenle ilgili çalışmalar için uygun değildir. Diyabet gibi faktörler GAPDH ekspresyonunun artmasına neden olabilir. | |
| Vinkulin | 117 | Büyük molekül ağırlıklı proteinler için kullanılabilir. | |
| Mitokondri | COXIV Serisi | 15-17 | Bu protein serisi esas olarak 15-17KDa'da yoğunlaşmıştır. Hedef protein moleküler ağırlığı yakınsa, diğer yükleme kontrol antikorlarını düşünün. |
| HSP60 | 60 |
| |
| Çekirdek | VDAC1/2 | 31-37 | Bu protein serisi ağırlıklı olarak 31-37KDa'da yoğunlaşmıştır. |
| Lamin B1 | 66 | Embriyonik kök hücreler için uygun değildir, yükleme kontrolü olarak uygun değildir apoptoz deneylerinde. | |
| PCNA | 36 | Proliferasyon göstermeyen hücreler için uygun değildir. | |
| TBP | 33-43 | TBP insanlarda 37-43KDa, fare ve sıçanlarda ise 33-36KDa olup apoptozis deneyleri için uygun değildir. | |
| YY1 | 65-70 |
| |
| Histon H3 | 17 | Çoğu proteinin yaklaşık 17KDa'lık bir moleküler ağırlığı vardır. Hedef proteinin moleküler ağırlığı yakınsa, diğer loadong kontrol antikorlarını düşünün. | |
| Tam Kan, Serum, Plazma | Transferin | 77 | İfade, retinoik asit gibi bazı hastalık durumları ve tedavilerden etkilenir. |
| Albümin | 66 | İçerik son derece yüksektir, WB deneylerinde örnek yüklemesinin azaltılmasına dikkat edilmelidir. |
Etiket Antikorları Birlikte Kullanıldığında Daha İyi Çalışır
Protein etkileşimlerini inceleyen deneylerde, örneğin çekme-aşağı, epitop etiketleri moleküler biyolojik yöntemlerle hedef proteinin N veya C terminaline kaynaştırılabilir. Yaygın olarak kullanılan epitop etiketleri arasında His, HA, Myc ve GST bulunur. Bu epitop etiketleri genellikle hedef proteinin biyolojik aktivitesini ve hücre içi lokalizasyonunu etkilemez. Epitop etiketlerinin ortaya çıkması bilimsel araştırma ve endüstriyel üretim için kolaylık sağlamıştır.
| Epitop Etiketi | Etiket Dizisi | Moleküler Ağırlık (KDa) |
| HA Etiketi | YPYDVPDYA | 1.1 |
| Myc Etiketi | EŞİTLİK | 1.2 |
| Bayrak Etiketi | DYKDDDDK | 1 |
| GST Etiketi | - | 26 |
| GFP Etiketi | - | 26.9 |
| V5 Etiketi | GKPIPNPLLGLDST | 1.4 |
| S-etiketi | KETAAAKFERQHMDS | 1.8 |
| E-etiket | GAPVPYPDPLEPR | 1.4 |
Ürün Bilgileri
| Tip | Ürün Adı | Moleküler Ağırlık (KDa) | Ürün Numarası |
| Yükleme Kontrol Antikoru | β-aktin, Fare mAb | 42 | 30101ES |
| β-aktin, Tavşan pAb | 42 | 30102ES | |
| GAPDH (Klon: 1A6), Fare mAb | 36 | 30201ES | |
| GAPDH, Tavşan pAb | 36 | 30202ES | |
| α-Tubulin, Fare mAb | 50-55 | 30304ES | |
| β-Tubulin, Fare mAb | 50-55 | 30301ES | |
| β-Tubulin, Tavşan pAb | 50-55 | 30302ES |