1.Laminin 521'in Arkaplanı
Laminin 521 (LN521), doğal kök hücre nişinde önemli bir hücre yapışma proteinidir ve insan embriyonik (hES) ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinin (hiPSC) kültürü ve genişlemesi için bir matristir. LN521, hücre yüzey reseptörlerine bağlanır ve hücre sinyal yollarını aktive ederek daha işlevsel hücrelerin üretilmesini sağlar.
Laminin 521, in vitro biyolojik olarak ilgili hPSC ortamını yeniden üretir, hPSC'nin bağlanmasını, yüksek hayatta kalmasını ve güçlü uzun vadeli kendini yenilemesini teşvik eder ve kök hücre büyümesini destekleyen ve bazal membran yapısının ve performansının stabilitesini koruyan bir anahtar matris proteinidir. Laminin 521 ayrıca en yaygın kullanılan besin içermeyen kültür matrislerinden biridir. Ek olarak, Laminin 521 herhangi bir apoptoz inhibitörü eklenmeden genetik olarak kararlı ve pluripotent kök hücrelerin verimli tek hücreli geçişini sağlayabilir. Hücreler, herhangi bir farklılaşma alanını manuel olarak çıkarmaya gerek kalmadan tekdüze bir tek katman halinde büyür. Ek olarak, çalışmalar LN521'in karyotip anormalliği belirtisi olmadan 10 nesilden fazla PSC büyümesini destekleyebileceğini ve PSC'nin iç, orta ve dış germ katmanları olmak üzere üç germ katmanına farklılaşma yeteneğini koruyabildiğini göstermiştir.
Şekil 1. Laminin 521 yapısı [1]
2. Laminin kaplama deneyi
2.1 Laminin 521'i steril deiyonize su veya enjeksiyonluk su ile 400µg/ml'ye hazırlayın. Kullanmadan önce steril 1×DPBS (Ca++/Mg++) ile 100µg/ml'ye kadar seyreltmeniz ve ardından steril DPBS (Ca++/Mg++) ile 5-10µg/ml'lik bir çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltmeniz önerilir. Kaplama konsantrasyonu, kültürlenen hücrelerin türüne bağlı olarak değişir ve hücreler için optimum kaplama konsantrasyonunu belirlemek üzere deneysel protokolün optimize edilmesi önerilir. Önerilen konsantrasyonlar için Tablo 1'e bakın.
Not: Ca içeren DPBS2+ ve Mg2+ kullanılmalıdır, çünkü iki değerlikli katyonlar protein yapısı ve işlevi için önemlidir. Laminin 521'in gerekli çalışma konsantrasyonu hücrelere ve uygulamaya bağlıdır. 0,5 μg/cm'lik bir başlangıç kaplama konsantrasyonu öneriyoruz2.
Tablo 1. Farklı kültür kapları için rekombinant insan laminin çalışma solüsyonunun önerilen hacimleri.
| Petri kabı | Kaplama konsantrasyonu (μg/mL) | LN521'in ek miktarı | 1*DPBS'nin ilave miktarı | Toplam hacim |
| 6 iyi | 5 | 50 μL/kuyu | 950 μL/kuyu | 1 mL/kuyu |
| 12 iyi | 5 | 25 μL/kuyu | 475 μL/kuyu | 0,5 mL/kuyu |
| 24 iyi | 5 | 15 μL/kuyu | 285 μL/kuyu | 0,3 mL/kuyu |
| 48 iyi | 5 | 7,5 μL/kuyu | 142,5 μL/kuyu | 150 μL/kuyu |
| 96 iyi | 5 | 3,5 μL/kuyu | 66.5 μL/kuyu | 70 μL/kuyu |
| 35mm Petri kabı | 5 | 50 μL/kuyu | 950 μL/kuyu | 1 mL/kuyu |
| 60mm Petri kabı | 5 | 100 μL/kuyu | 1900 μL/kuyu | 2 mL/kuyu |
| 100mm Petri kabı | 5 | 300 μL/kuyu | 5700 μL/kuyu | 6 mL/kuyu |
Yukarıdaki hacim 5μg/mL kaplama konsantrasyonuna dayanmaktadır.
2.2 Her kuyuya belirtilen hacimde laminin-DPBS karışımı ekleyin ve hafifçe çalkalayın. Tüm yüzeyin laminin kaplama solüsyonuyla kaplandığından emin olun, çünkü kaplanmamış yüzeyler hücre büyümesini desteklemez.
2.3. Plakayı 37°C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve bir gece inkübe edin. Minimum inkübasyon süresi 2 saattir, ancak ideal hücre kültürü koşullarını elde etmek için bir gece inkübasyon önerilir. Kültür kabının kurumasına izin vermemeye dikkat edin, bu LN521'i inaktive edecektir.
2.4. Hücreler ekilmeye hazır olduğunda laminin 521 solüsyonunu aspire edin.
3.iPSC Kültürü
3.1 iPSC çözülmesi (örnek olarak 12-kuyulu plakayı ele alalım)
3.1.1 iPSC’leri sıvı nitrojenden veya kuru buzdan çıkarın ve 37°C suda 10 saniye çözün.
3.1.2 Kriyovyalleri %75’lik alkol ile sterilize edin ve çalışma yüzeyine aktarın.
3.1.3 Hücreleri 9 mL DMEM‑F12 içeren yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
3.1.4 15 mL santrifüj tüpünü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin.
3.1.5 Kaplanmış 12-kuyulu plakadan laminin çözeltisini atın.
3.1.6 Hücre üst sıvısını atın ve iPSC'leri 1 mL mTeSR-plus'ta (10 µM Y-27632 içeren) nazikçe yeniden süspanse edin ve kaplanmış 12 kuyulu plakaya aktarın. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı çalkalayın ve kuyu başına 1×10^5 hücrelik son hücre yoğunluğuna getirin ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Kültürün 4-5 gün içinde pasajlandığından emin olun.
3.1.7 12 kuyulu plakayı inkübasyon için 37°C'lik inkübatöre geri koyun.
3.1.8 ROCK inhibitörü içeren kültür ortamı 12-16 saat sonra uzaklaştırılmalı ve inhibitörsüz ortamda kültüre devam edilmelidir.
Tablo 2. Farklı kültür kaplarındaki hücre ekim yoğunluğu, hücre sayısı hücre büyüme hızına göre belirlendi
| Hücre kültürü kapları | 6 iyi | 12 iyi | 24 iyi | 96 iyi |
| Hücre numarası | 2,5~3,5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0,5~1×104 |
3.2. iPSC Geçiş Protokolü
3.2.1 Kültür üst sıvısını atın ve 1 mL PBS (Ca) ile yıkayın.‑‑/Mg‑‑).
Not: Ca2+ ve Mg2+ içermeyen PBS kullanın, çünkü iki değerlikli katyonlar bazı ayrışma enzimleri üzerinde olumsuz etkiye sahiptir.
3.2.2 PBS'yi atın ve 0,5 mL Yumuşak Hücre Ayrıştırma Reaktifi ekleyin.Hücreler plakaya bağlı kalmayıncaya kadar oda sıcaklığında 6-8 dakika inkübe edin veya mikroskop altında gözlemleyin.
3.2.3 Eşit hacimde DMEM-F12 ekleyin, hücreleri yavaşça karıştırın, oda sıcaklığındaki bir santrifüj tüpüne aktarın ve 300 g'de 5 dakika santrifüjleyin.
3.2.4 Hücreleri pasajlamadan önce, laminin kaplı 12 kuyulu bir plaka hazırlayın.
3.2.5 Üstteki sıvıyı atın ve hücreleri 10 içeren mTeSR-plus ortamında yeniden süspanse edin. µM Y‑27632.
3.2.6 Hücreleri hazırlanan laminin kaplı 12-kuyulu plakaya aktarın. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe çalkalayın ve oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika bekletin.
3.2.7 12-kuyulu plakayı 37°C’lik inkübatöre yerleştirin ve inkübe edin.
Not: iPSC'ler tek tabakaya dönüştükten sonra hızla farklılaşacak ve ölecektir. Büyüme ve çok yönlülüğü sürdürmek için, birleşmeden önce geçirilmeleri gerekir.
3.3. iPSC'nin kriyoprezervasyonu
3.3.1 Nazik hücre ayrıştırma reaktifini hazırlayın.
3.3.2 Hücre ayırma işlemini iPSC pasaj protokolüne göre yapın, kriyoprezervasyon öncesi hücre yoğunluğunu sağlamak için hücre organel sayımını kullanın.
3.3.3 Her hücre tüpü 1-2×10^6 hücre yoğunluğunda dondurulmalıdır. iPSC pasajlama protokolünde santrifüjleme ve hücre kültürü ortamının çıkarılması adımlarını izleyin. İzole edilmiş iPSC peletini uygun hacimde kriyoprezervasyon solüsyonunda yeniden süspanse edin
3.3.4 1,5 mL kriyoprezervasyon tüpüne 1 mL resüspanse edilmiş hücre kriyoprezervasyon peletini ekleyin, program soğutmasını gerçekleştirin ve daha sonra uzun süreli saklama için sıvı nitrojene aktarın.
4. Laminin Kaplama Hakkında Önemli Notlar
4.1. Deney protokolündeki tüm adımlar steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
4.2. Laminini uzun süre oda sıcaklığına maruz bırakmaktan kaçınınız.
4.3. Tekrarlanan dondurma ve çözme işlemlerinden kaçının
4.4. Çözüldükten sonra seyreltilmemiş protein stok solüsyonu steril koşullar altında 2~8℃'de saklanabilir ve en az 3 ay boyunca stabil olarak saklanabilir.
5.İlgili ürün bilgileri
| Ürün Adı | Kedi# | Boyut |
| 92602ES | 10μg/100μg/500μg/1mg |
6.Referanslar
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E. Laminin β2 kısa kolunun kristalografik analizi, LF alanının düzenli bir LE alanı dizisine nasıl yerleştirildiğini ortaya koymaktadır. Matrix Biol. 2017 Ocak;57-58:204-212.