Telomerler ve Protelomeraz söz konusu olduğunda biyolojide, insanların aklına ilk gelen şey kaçınılmaz bir doğal fenomen olan yaşlanmadır. Telomerler dır ökaryotik kromozomların uçlarındaki tekrarlayan DNA dizileri, kromozom bütünlüğünün korunması ve hücre bölünme döngüsünün düzenlenmesi sorumluluğu.
Protelomeraz telomerleri uzatan bir ters transkriptaz DNA sentez enzimidir. RNA ve proteinlerden oluşan bir nükleoproteindir. Protein bileşeni telomer tekrar dizilerinin sentezini katalize edebilir RNA bileşeni ile.
Şekil 1. Protelomeraz aracılı Telomer Uzamasının Mekanizması[1]
Protelomeraz telomerleri onarabilir ve uzatabilir, DNA replikasyonundaki kusurları telafi edebilir, hücre bölünmesi sırasında telomer kaybını önleyebilir ve hücre bölünmelerinin sayısını artırabilir. 2009 yılında, Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü, Telomerlerin ve Protelomerazın kritik rolünü ortaya koyma konusundaki olağanüstü katkılarından dolayı Elizabeth H Blackburn, Carol W Greider ve Jack W Szostak'a verildi hücresel fonksiyon ve yaşlanmada.
Bugün size benzersiz bir Protelomeraz tanıtmak istiyorum: TelN proProtelomeraz. TelN Protelomeraz N15 bakteriyofajından gelir ve N15 replikasyon sisteminin bir bileşenidir, katılır doğrusal profaj DNA'sının oluşumunda. Protelomerazın aksine ökaryotlarda TelN, herhangi bir RNA bileşeni olmayan saf bir protein enzimidir. Bölme-bağlama özelliğine sahiptir aktivite gösterir ve çift sarmallı DNA'yı (dsDNA) kestikten sonra kopma noktasında kovalent olarak kapalı bir uç bırakır.
Şekil 2. TelN Protelomeraz Bölünme Yeri
TelN Protelomeraz Etki Mekanizması
TelN Protelomerazın tanınma yeri 56 bp uzunluğunda, her iki tarafında telR ve telL bulunan bir palindrom dizisidir. Hedef dizinin merkezi konumu da bir palindrom dizisidir telO. TelN Protelomeraz telO dizisi içinde kesilir ve iki kesme ucunda kovalent olarak kapalı bir saç tokası yapısı oluşturur. Sindirimden sonra DNA'nın ucu hala telR ve telL'den oluşur ve bu da köpek kemiği DNA (dbDNA).
Şekil 3. Protelomeraz TelN sitesindeki bölünme mekanizması[2]
TelN Protelomerazın özel enzim kesme-bağlama aktivitesi nedeniyle, dairesel plazmit DNA'sı tek adımlı enzimatik reaksiyonla doğrusal kovalent olarak kapalı halter şeklindeki moleküllere dönüştürülebilir. Doğrusal açık DNA molekülleriyle karşılaştırıldığında, doğrusal kapalı DNA hücrelerde daha yüksek protein ifade düzeyine sahiptir ve bu da yüksek stabilite ve minimum yabancı diziye sahip doğrusal kapalı uçlu mini DNA oluşturmak için çok uygundur. Plazmit DNA, mRNA aşısı, DNA aşısı ve hücre gen terapisinin temel unsuru olarak hayati bir rol oynar. Geleneksel plazmit üretim yöntemi, fermantasyonu içerir E. koli basili ve çok aşamalı amplifikasyon ve fermantasyon sürecindeki kontrol edilemeyen risk, aşıların üretim kapasitesini sınırlamanın anahtarı haline gelen yüksek kaliteli plazmidin verimini sınırlar. İngiltere'deki Touchlight şirketi yenilikçi bir dbDNA teknolojisi başlattı. Bu teknoloji, plazmid DNA hazırlama için geleneksel bakteriyel fermantasyon yöntemini bozar ve bunun yerine DNA'nın in vitro enzimatik sentezini kullanır. TelN Protelomeraz'ın özel enzim kesme-bağlama aktivitesi, yukarıdaki yöntemde doğrusal kapalı uçlu mini DNA üretmek için de kullanılır.
TelN Protelomerazın DNA Enzimatik Sentezinde Uygulanması
Phi29 DNA polimeraz ve TelN Protelomeraz bazlı DNA in vitro enzimatik yöntemi, biyolojik fermantasyon sürecindeki birçok kontrol edilemeyen riski önleyebilir ve in vitro enzimatik yöntem, DNA'yı hızlı bir şekilde ve yüksek verimle sentezleyebilir. Sentezlenen DNA, mRNA aşısı, DNA aşısı, gen terapisi vektörü ve gen düzenleme gibi birçok yeni teknolojide kullanılabilir.
Şekil 4. DNA enzimatik sentezinin akış şeması[3]
Enzimatik DNA Sentezi İşlemi
- Şablon denatürasyonu
Dairesel plazmit DNA şablonu, denatürasyon süreciyle iki adet tek zincirli dairesel DNA'ya dönüştürülür.
- Yuvarlanan daire amplifikasyonu
Protelomeraz tanıma dizisi aralıklarına sahip uzun doğrusal çift sarmallı konkatemerik DNA üretmek için Phi29 DNA polimeraz ve tek sarmallı dairesel DNA kullanılarak yuvarlanan daire amplifikasyonu gerçekleştirildi.
- Kesme ve Kovalent Kapatma
TelN Protelomeraz, telomerik komplekslerin DNA'sındaki telRL'yi tanır ve doğrusal, kovalent olarak bağlı DNA monomerleri oluşturmak için kesme-bağlama aktiviteleri gerçekleştirir.
- Bakteriyel omurga DNA'sının çıkarılması
Restriksiyon endonükleazları veya ekzonükleazları, yalnızca hedef gen ekspresyon elemanlarını içeren DNA elde etmek için sonunda açık bir yapı olan bakteri iskeleti DNA'sını bozar. DNA teknolojisinin enzimatik sentezi biyolojik fermantasyonu atlar ve GMP düzeyinde plazmit DNA sentezini hızla gerçekleştirerek gen terapisi ve mRNA aşıları alanlarındaki üretim kapasitesi sınırlamalarını çözer. Endüstriyelleşme için muazzam bir potansiyele sahiptir. DNA enzimatik sentez teknolojisinin gelişimini desteklemek için YEASEN Biology, DNA enzimatik sentez teknolojisinin araştırılması ve üretilmesine yardımcı olmak için phi29 DNA polimeraz (14404ES) ve TelN Protelomeraz (14540ES) gibi DNA enzimatik sentezi için temel enzim malzemeleri sağlayabilir.
Pperformans sunumu YEASEN'in TelN Protelomeraz
- Yarma-bağlama performansı mükemmel olup, ithal markalara eşdeğerdir.
TelN Protelomeraz tanıma bölgesini şablon olarak içeren süper sarmal bir plazmid kullanılarak, YEASEN ve marka A'dan gelen gradyan ekleme (0.078-5 U) enzimi eklendi. 0.5 μg süper sarmal plazmid, kapalı doğrusal çift sarmallı DNA'ya (dsDNA) dönüştürüldü. Dönüşüm verimliliğini tespit etmek için jel elektroforezi kullanıldı ve sonuçlar YEASEN'in TelN Protelomerazının kesme ve bağlama aktivitesinin Marka A'nın aktivitesine eşdeğer olduğunu gösterdi.
Şekil 5. TelN M:Marker, C: süper sarmal plazmit kontrolünün proteomeraz kesme aktivitesi tespiti
- Doğrusal dsDNA'nın kapanış bütünlüğü > %90
Şablon olarak TelN Protelomeraz tanıma bölgesini içeren süper sarmal plazmid kullanılarak, YEASEN'in TelN Protelomerazı ve marka A eklenerek, süper sarmal plazmidin 0,5 μg'ı kapalı doğrusal dsDNA'ya dönüştürülerek ve bant bozunma derecesi yoluyla uç bütünlüğünü tespit etmek için T5 ekzonükleaz eklenerek. Sonuçlar, YEASEN'in TleN Protelomerazı tarafından oluşturulan dsDNA uç kapanış bütünlüğünün %90'dan fazla olduğunu ve bunun marka A'nınkine eşdeğer olduğunu gösterdi.
Şekil 6. TelN Protelomeraz uç kapanış bütünlüğü testi. C1: TelN Protelomeraz olmaksızın TelN tanıma bölgesi içeren plazmid; C2: T5 ekzonükleaz olmaksızın TelN Protelomeraz, TelN tanıma bölgesi içeren plazmid; Plazmid: TelN tanıma bölgesi içeren plazmid.
İlgili Ürünler ile ilgili DNA Enzimatik Sentezi
| Ürün Sınıflandırması | Ürün Adı | Katalog No. |
| Protelomeraz | 14540ES | |
| Phi29 DNA Polimerazı | 14404ES | |
| Ekzonükleaz | Ekzonükleaz III | 14525ES |
| 14538ES | ||
| dNTP | 10125ES |
Rreferanslar
[1] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. Telomer ve Protelomeraz biyoloji. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Prokaryotik kesme-birleştirme enzimi TelN tarafından üretilen doğrusal kapalı mini DNA memeli hücrelerinde işlevseldir. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Prokaryotik kesme-birleştirme enzimi TelN tarafından üretilen doğrusal kapalı mini DNA memeli hücrelerinde işlevseldir. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.