Glikoproteomik ve antikor ilaç araştırmalarının hızla gelişmesiyle birlikte, glikozilasyon modifikasyonu da büyük ilgi görmüştür. Hücreler ve hücreler arasındaki ve hücreler ve patojenler arasındaki temas esas olarak şekerler ve proteinlerin etkileşimi yoluyla tamamlanır ve glikozilasyon glikokonjugatların yapışma özelliklerini belirler. IgG'de, Fc bölgesindeki Asn297'deki korunan N-bağlı glikozilasyon da aktivitesi için önemlidir. Ek olarak, bazı antikorlar ayrıca, Fc bölgesindeki Asn297'deki korunan bölgeyle birlikte antikorun tanınmasını, yarı ömrünü ve bağışıklık tepkisini etkileyen ek N-glikanlara sahiptir.
Protein glikozilasyonu, proteinler üzerindeki belirli bölgelerde glikan zincirlerinin bağlanmasını içeren karmaşık bir translasyon sonrası modifikasyondur. Glikan zincirinin türüne bağlı olarak glikoproteinler N-bağlı glikoproteinler, O-bağlı glikoproteinler vb. olarak ayrılır; ayrıca, protein glikozilasyonu konak hücre tipi ve fermantasyon koşullarından (kültür ortamı, pH değeri, sıcaklık vb. gibi) da etkilenir. Bu nedenle, glikoproteinler genellikle glikozilasyon bölgeleri, glikozilasyon seviyeleri ve glikan zincirlerinin özgül yapısı dahil olmak üzere glikozilasyon desenlerinde heterojenliğe sahiptir ve bu da glikan zinciri analizini ve yapısal karakterizasyon işini son derece zorlu hale getirir. Maksimum miktarda glikan zinciri yapısal bilgisi elde etmek için, glikan zinciri analizinin ana stratejisi önce glikan zincirlerini proteinlerden serbest bırakmak ve ardından ayrıntılı analiz ve karakterizasyon yapmaktır. Bu stratejide, verimli, doğru ve kararlı bir deglikozilasyon yöntemi çok önemlidir.
Deglikozilasyonda günümüzde enzimatik yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır.
Glikoproteinler, glikan zincirlerinin türlerine göre N-bağlı ve O-bağlı glikopeptitler olarak sınıflandırılabilir. N-bağlı glikopeptitler için yaygın olarak kullanılan enzimler arasında peptit N-glikozidaz F (PNGase F), endoglikozidaz H (Endo H) ve endoglikozidaz S (Endo S) bulunur. PNGase F, GlcNAc-Asn bağını hidrolize eder ve yüksek mannoz, kompleks ve hibrit glikan zincirlerini kaldırabilir. Endo H, N-glikan zincir pentasakkarit çekirdeğindeki glikozidik bağları keser. Endo S, özellikle doğal IgG'nin ağır zincirinin kitobiyoz çekirdeğinden N-bağlı glikanları keser.
Şekil 1. PNGase F, Endo H ve Endo S'nin kesim yeri.
Bunların arasında PNGase F N-bağlı bakterilerin neredeyse tamamının uzaklaştırılmasında en etkili enzimatik yöntemdir glikoproteinlerdeki oligosakkaritler, asparaginle bağlı yüksek mannozlu, hibrit ve kompleks oligosakkarit glikoproteinlerini parçalayabilir ve özellikle N-bağlı glikanları çıkarabilir. Parçalama yeri: en içteki N-asetilglukozamin (GlcNAc) ile asparagin kalıntısı arasındaki amid bağıdır, enzimatik hidrolizden sonra protein üzerindeki asparaginin aspartik aside dönüştürülmesi.
α1-6 fukoz GlcNAc çekirdeğinde yer aldığında PNGase F de kesebilir; ancak α1-3 fukoz GlcNAc çekirdeğinde yer aldığında (bitki ve böcek glikoproteinlerinde yaygındır) PNGase F kesemez.
Ancak, geleneksel PNGase F enzimatik reaksiyonu antikor N-glikanlarını serbest bırakmak için birkaç saat gerektirir ve glikan salınımına yönelik tercih nedeniyle, eksik deglikozilasyon önyargılı sonuçlara yol açabilir ve elde edilen glikan dağılımı terapötik antikorların doğru bileşimini temsil etmeyebilir. Bu nedenle, antikorların ve antikor füzyon proteinlerinin ve diğer biyoterapötik ajanların üretim süreci sırasında glikozilasyon izleme için mümkün olduğunca çabuk doğru bir N-glikan profili elde etmek çok önemlidir.
Hızlı PNGase F
Hızlı PNGase F, antikorları, immünoglobulinleri, füzyon proteinlerini ve diğer glikoproteinleri birkaç dakika içinde hızla ve tamamen deglikosile edebilen optimize edilmiş bir rekombinant reaktiftir. Bu enzim, tüm N-glikanları hızlı ve tercihsiz bir şekilde ortadan kaldırabilir ve doğrudan akış aşağı kromatografisi veya kütle spektrometrisi analizi için kullanılabilir. Yeasen Hızlı PNGase F, N-glikozidaz F (Hızlı Versiyon), deneysel süreci basitleştirir, deneysel süreyi azaltırken hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği garanti eder.
Ürün Özellikleri:
Hızlı: Birkaç dakika içerisinde tam ve hızlı deglikozilasyon.
Yüksek Saflık: Proteaz, glikozidaz kontaminasyonu yok, saflık ≥%95.
Seçici olmayan: Hızlı ve tercihsiz bir şekilde tüm N-glikanları uzaklaştırın.
İyi Uyumluluk: Doğrudan akış aşağı kromatografisi veya kütle spektrometrisi analizlerinde kullanılır.
Test Verileri:
Tek adımlı protein deglikozilasyonu:
- 10 ug substrat/100 ug antikor ve ddH2O toplam hacim 16 uL olacak şekilde karıştırılır;
- 4 μL Hızlı PNGase F Tamponu (5x) ekleyin, son hacim 20 uL;
- 1 μL Fast PNGase F ekleyin.
- 50°C’de 10 dakika inkübe edin.
Şekil 2. Protein substratı (A) ve antikor (B) üzerinde tek adımlı enzimatik kesme etkisi.
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: Rakip + substrat veya antikor 3: Rakip + substrat veya antikor 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: Substrat veya antikor 7: Yeasen Fast PNGase F 8: Rakip
İki aşamalı protein deglikozilasyonu:
- 10 ug substrat/100 ug antikor ve ddH2O toplam hacim 16 uL olacak şekilde karıştırılır;
- 4 μL Hızlı PNGase F Tamponu (5x) ekleyin, son hacim 20 uL;
- 80°C’de 2 dakika inkübe edin, oda sıcaklığına soğutun.
- 1 μL Fast PNGase F ekleyin.
- 50°C’de 10 dakika inkübe edin.
Şekil 3. İki adımlı enzimatik kesme etkisi protein substrat (A) ve antikor (B) üzerinde.
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: Rakip + substrat veya antikor 3: Rakip + substrat veya antikor 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: Substrat veya antikor 7: Yeasen Fast PNGase F 8: Rakip
Çözüm:
- Yeasen Fast PNGase F, aynı reaksiyon koşulları altında ithal edilen rakipleriyle aynı veya daha yüksek enzimatik kesme verimliliğine sahiptir;
- Daha yüksek enzimatik kesme etkinliği sağlamak için iki adımlı enzimatik kesme yapılması önerilir. Bazı antikorlar (örneğin Fab N-glikozilasyon) ön ısıtma adımı gerektirir
verimli deglikozilasyon için.
Ayrıca Yeasen Ayrıca düzenli PNGase F(Cat#20407ES, özgül aktivite: 100000 U/mL) ve Endo H glikozidaz H (Cat#20414ES), Endo S glikozidaz S (Cat#20413ES) gibi diğer glikozidaz tiplerini de sağlar.
Satınalma Rehberi
| Ürün kodu | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| Ürün Adı | Hızlı PNGaz F | PNGaz F | Endo H | Endo S |
| Kaynak | Maya rekombinant ekspresyonu | Maya rekombinant ekspresyonu | Maya rekombinant ekspresyonu | E. coli bakterisi rekombinant ifade |
| Belirli Aktivite | Uygulanamaz | 100000U/mL | 1000000U/mL | 8000 U/mg |
| Bölünme Yeri | Neredeyse tüm N-bağlı glikanların | Neredeyse tüm N-bağlı glikanların | N-bağlı yüksek mannoz glikanlar | IgG ağır zincirinin çekirdek disakkarit yapısı içinde parçalanır |
| Sindirim Zamanı | 10 dk | 1-3 saat | 1-3 saat | 1 saat |
| Glikozilasyon | Uygun | Uygun | Uygun | Uygun |
| Protein Yapısı | Uygun | Uygun | Uygun | Uygun |
Sipariş Bilgileri
| Ürün Adı | Ürün Numarası | Şartname |
| 20406ES20/50 | 20T/50T | |
| 20407ES01/02 | 15000 TL /75000 TL | |
| 20414ES92/97 | 10000 TL /50000 TL | |
| 20413ES80/90 | 1000U/5 x 1000U |