Hızlı gelişmeyle birlikte Prutin SBilim, protein saflaştırma teknolojisi biyolojik araştırma ve biyoteknoloji endüstrisinde giderek daha önemli bir rol oynamaktadır. Temel bir teknik olarak, hedef proteinin kodlama bilgisinin genetik mühendislik yöntemleriyle konak hücrelere entegre edilmesini içerir, böylece gerekli proteinleri verimli bir şekilde üretmeleri sağlanabilir. Daha sonra, proteinlerin yüksek saflıkta çıkarılmasını sağlamak için bir dizi karmaşık in vitro işlem adımı gerçekleştirilir. Protein saflaştırma, bilim insanlarının proteinlerin yapısı ve işlevi, yeni ilaçların geliştirilmesi, hastalık teşhisi ve biyoteknolojinin uygulanmasının teşviki üzerine derinlemesine çalışmalar için çok önemli olan tek tip proteinleri izole etmesini sağlar. Bu teknoloji yalnızca bilimsel deneylerin doğruluğunu sağlamakla kalmaz, aynı zamanda yaşam bilimlerinin gelişimini sürekli olarak yönlendirir.
Şekil 1. Afinite kromatografisinin şematik diyagramı[1]
Protein mühendisliği alanında, füzyon etiketleri hedef proteinlere bağlanarak çeşitli deneysel amaçları kolaylaştırabilen güçlü bir araç görevi görür. Ortak füzyon etiketlerinin işlevleri referans olması için aşağıdaki tabloda listelenmiştir. Ancak, bu etiketler başlangıçtaki yardımcı işlevlerini yerine getirdikten sonra füzyon proteinleri üzerinde kaldıklarında, sonraki deneyler üzerinde olumsuz etkilere sahip olabilirler, örneğin hayvan immünolojik deneylerine müdahale edebilir veya proteinlerin biyolojik aktivitesini etkileyebilirler. Bu nedenle, proteinlerin normal işlevini ve deneylerin doğruluğunu sağlamak için bu gereksiz füzyon etiketlerini çıkarmak çok önemlidir.
Tablo 1. Ortak Füzyon Etiketlerinin ve Enzim Kesme Yöntemlerinin İşlevlerine Giriş
| Füzyon etiketi | Boyut (K.D.)A) | İşlev | Yaygın enzimatik ayırma yöntemleri |
| Onun | 0,84 | Saflaştırma açısından faydalıdır, çözünür/inklüzyon cisimcikleri proteinlerini saflaştırma yeteneğine sahiptir. | TEV Proteazı |
| Bayrak | 1.01 | F ile kaynaşmış amaç proteinigecikme Etiket, F'ye karşı antikor tarafından tanınabilirgecikme, böylece F içeren füzyon proteinigecikme Etiket Western Blot, ELISA ve diğer yöntemlerle tespit edilip tanımlanabilir. | Enterokinaz |
| GST | 26 | Protein çözünürlüğünü arttırır, sadece çözünür proteinleri saflaştırabilir ve toksik proteinleri koruyabilir. | Trombin |
| MBP | 44.4 | Protein çözünürlüğünü artırın ve toksik proteinleri korur. | TEV Proteazı |
| NusA | 55 | Protein çözünürlüğünü artırın ve toksik proteinleri korur. | Trombin |
| SUMO | 11.2 | Proteinlerin çözünürlüğünü artırın, proteinin proteolitik aktivitesini teşvik edin hidrolizi sağlar ve proteinlerin stabilitesini artırır. | SUMO Proteazı |
Bugün, füzyon etiketlerinin etkili ve hassas bir şekilde çıkarılması için son teknoloji ürünü UCF.ME'yi sizlere tanıtmaktan mutluluk duyuyoruzT.M. rTEV Proteaz. Basit ve kullanımı kolay deneysel prosedürüyle bu enzim, füzyon proteinlerinden gereksiz etiketleri kolayca ayırabilir ve böylece yüksek saflıkta hedef proteinler elde edebilir.
UCF.BENT.M. rTEV Proteaz
TEV Proteaz, rekombinant protein füzyon etiketlerinin kesilmesinde yaygın olarak kullanılan, yüksek bölge özgüllüğüyle bilinen bir proteazdır. Yedi amino asitli EXXYXQ↓(G/S) dizisini kesin bir şekilde tanır ve glutamin ile glisin veya serin arasında hassas kesme gerçekleştirir. En yaygın yedi amino asitli dizi Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly'dir. Bu özgüllük, protein işleme prosedüründe doğruluğu ve verimliliği garanti eder.
Şekil 2. TEV proteazının etki mekanizmasının şematik diyagramı[2]
UCF.BENT.M. rTEV Proteaz, genetik olarak tasarlanmış ve ince bir şekilde saflaştırılmış bir rekombinant proteazdır. Sadece doğal TEV enziminin tam işlevsel aktivitesini korumakla kalmaz, aynı zamanda daha geniş bir sıcaklık aralığında mükemmel stabilite ve özgüllük de gösterir. The konak gDNA kalıntısı t'ninonun ürünü çok düşük, pratik uygulamalarda protein füzyon etiketlerinin daha yüksek kesme verimliliğini garanti altına alır ve ekzojen madde kalıntılarının girme riskini etkili bir şekilde azaltır. UCF.BENT.M. rTEV Proteaz, pH 7,0 ve 30°C koşulları altında optimum aktivite gösterir. Ancak, farklı protein işleme gereksinimlerini karşılamak için pH 6,0-8,5 ve sıcaklık 4-30°C gibi geniş bir koşul aralığında bile aktivitesini korur. UCF.ME'ninT.M. rTEV Proteazının N-terminusunda 6×His etiketi bulunur ve bu etiket Ni-NTA reçinesi ile etkili bir şekilde uzaklaştırılabilir ve böylece hedef proteinin hassas bir şekilde saflaştırılması sağlanabilir.
Performans gösterimi
1. Yüksek kesme verimliliği: Protein etiketi daha kapsamlı bir şekilde kesilir
UCF.ME'yi içeren füzyon proteinini (3 μg) kullanarakT.M. rTEV Proteaz kesme bölgesi substrat olarak, UCF.MET.M. 10, 5 ve 3 U'da rTEV Proteaz sırasıyla eklendi ve reaksiyon 1 saat boyunca 30°C'de gerçekleştirildi. Kesme etkisi agar jel elektroforezi ile tespit edildi. Sonuçlar Y'ninkolaylaştırmakUCF.ME'ninT.M. Giriş miktarı 3 U'dan fazla olduğunda rTEV Proteaz, %90'ın üzerinde bir ayırma verimliliğiyle substratı etkili bir şekilde ayırabilir.
Şekil 3. UCF.ME'nin bölünme aktivitesinin doğrulanmasıT.M. rTEV Proteaz
2. Düşük konak gDNA kalıntısı: Ekzojen madde kalıntılarının girme riskini etkili bir şekilde azaltın
Ana bilgisayarı test ederek (E. koli basili) UCF.ME'nin farklı gruplarındaki gDNA kalıntılarıT.M. rTEV Proteaz, sonuçlar UCF.ME'nin konakçı gDNA kalıntısınınT.M. rTEV Proteazı <1 kopya/U'nun çok altındaydı.
Şekil 4. UCF.ME'deki konak gDNA kalıntısının sonuçlarıT.M. rTEV Proteaz
3. Geniş uygulama koşulları: Farklı protein işleme gereksinimlerini karşılayabilir.
UCF.ME'nin bölünme aktivitesini doğrulayarakT.M. rTEV Proteaz farklı koşullar altında, sonuçlar UCF.ME'ninT.M. rTEV Proteaz, 4-30°C koşullarında güçlü bir aktiviteye sahip olup, müşterilerin farklı uygulama gereksinimlerini karşılayabilmektedir.
| Tepki süresi (H) | Farklı sıcaklıklarda bölünme aktivitesi (%) | |||
| 4℃ | 16℃ | 21℃ | 30℃ | |
| 1 | 34 | 58 | 56 | 85 |
| 2 | 58 | 80 | 78 | 90 |
| 3 | 71 | 99 | 99 | 99 |
| 3.5 | 84 | 99 | 99 | 99 |
Senkolaylaştırmak'nin önerilen füzyon etiketi kesme protein ürünleri
| Ürün İsim | Ürün Nkoyu kahverengi | |
| TEV Proteaz | UCF.BENT.M. rTEV Proteaz | 20427Türkçe |
| Enterokinaz | Enterokinaz, Rekombinant | 20395ES |
| SUMO Proteazı | SUMO Proteazı | 20410ES |
| 3C Proteaz | 3C Proteaz | 20409ES |
Referanslar：
[1] Parikh I, Cuatrecasas P. Afinite Kromatografisi[J].Vox Sanguinis, 1972, 23(1-2):141-146.DOI:10.1159/000466530.
[2] Paththamperuma C, Sayfa R C. TEV proteazının aktivitesi için floresan söndürme testi[J]. Analitik biyokimya, 2022, 659: 114954.