Ancak, T4 DNA Ligazı, zayıf stabilite, yüksek adaptör-adaptör ligasyonu veya düşük DNA kütüphane verimi gibi pratik uygulamalarda hala bazı zorluklarla karşı karşıyadır. Bu sorunlar, deneysel verimliliğin azalmasına, veri kalitesinin düşmesine, deneysel sonuçların tekrarlanabilirliğinin zayıf olmasına ve düşük ürün saflığına yol açabilir ve böylece moleküler biyoloji deneylerinin genel etkinliğini ve dizileme verilerinin doğruluğunu etkileyebilir. Bu sorunları ele almak için, yan kuruluşu Molefuture'ın yenilikçi ZymeEditor'ına dayanan Yeasen^™ Enzim evrim platformu T4 DNA ligase üzerinde enzim evrimi gerçekleştirdi.

Şekil 1 T4 DNA Ligaz Reaksiyon Prensibinin Şematik Diyagramı^[1]

Şekil 2 T4 DNA Ligazının Yapısı

Rasyonel tasarımın yanı sıra, T4 DNA ligazının yönlendirilmiş evrimi, stabilite, aktivite ve kalıntı aktiviteyi tarayarak MTPS yöntemi ile gerçekleştirildi. Ve 10'dan fazla⁴ mutantlar tarandı. Mutasyon verilerinin kapsamlı bir analizinin ardından, saflaştırma ve titiz testler için umut vadeden adaylar seçildi. Daha sonra rasyonel tasarım ve yönlendirilmiş evrimle elde edilen tüm kazananlar, rafine edilmiş saflaştırmadan sonra aktivite, kararlılık, adaptör kendi kendine bağlanması, DNA parçası kendi kendine bağlanması ve DNA verimi değerlendirmelerini kapsayan ayrıntılı karakterizasyona tabi tutuldu. G1 mutantlarına dayanarak, ekip Çeşitli uygulama gereksinimlerini karşılayan olağanüstü mutantlar elde etmek için DNA karıştırma işlemi gerçekleştirildi ve yönlendirilmiş mutasyon tasarımı birleştirildi.

Çoklu Dizi Doğrulama Turlarıyla Mutanttan Piyasa Ürününe

The Zyme Editörü^T.M. Enzim evrim platformu, enzim evrim teknolojisi sayesinde yüksek termal stabiliteye, yüksek kütüphane verimine ve düşük adaptör öz ligasyonuna sahip bir T4 DNA ligaz mutantını başarıyla evrimleştirdi. Şu anda geliştirilmiş olan T4 DNA Ligaz başarıyla piyasaya sürülmüştür - Hieff® Çok Yönlü T4 DNA Ligaz (600 U/μL) (Kat#12996ES). Bu ürün, ligasyon verimliliği ve termal stabilite açısından geleneksel vahşi tip T4 DNA Ligaz'dan daha üstün performans gösterir ve yüksek verimli dizileme ile doğrulanarak mükemmel kaliteyi garanti eder.

Veri Sunumu

1.Daha Yüksek Termal Kararlılık

Yeasen'den T4 DNA Ligaz mutantları 42℃'de ısı işlemine tabi tutuldu 0, 2 ve 4 saat boyunca ve Satıcı Q, N, A ve T'den alınan T4 DNA Ligazları ile karşılaştırıldı.Daha sonra, T4 DNA Ligaz'ın termal kararlılığını karşılaştırmak için 1 µg parçalanmış sığır gDNA'sı kullanılarak Yeasen DNA Kütüphanesi Yapım Kiti (Kat#12927ES) kullanılarak tüm genom DNA kütüphanesi oluşturuldu.

Şekil 3 42℃'de Termal Kararlılık Testi

Sonuçlar:

Termal Kararlılık: Yeasen ≈ Satıcı N ≈ Satıcı A > Satıcı T > Satıcı Q.

2.Daha Yüksek Kütüphane Verimi

Yeasen'den T4 DNA Ligaz mutasyonu, Satıcı Q, N, A ve T'den alınan T4 DNA Ligazlarıyla karşılaştırıldığında hem yüksek hem de düşük DNA girdi seviyelerinde kütüphane verimi açısından test edildi. DNA kütüphanelerini oluşturmak için 1 µg ve 0,5 ng parçalanmış sığır gDNA'sının girildiği Yeasen DNA Kütüphane İnşa Kiti (Kat#12927ES) kullanıldı.

Şekil 4 DNA Kütüphane Verim Analizi

Sonuçlar:

Kütüphane Verimi (1 µg gDNA): Yeasen > Satıcı Q ≈ Satıcı T ≈ Satıcı A > Satıcı N. Kütüphane Verimi (0,5 µg gDNA): Yeasen ≈ Satıcı Q ≈ Satıcı A ≈ Satıcı T > Satıcı N.

3.Alt Adaptör Kendiliğinden Bağlama

Yeasen'den T4 DNA Ligaz mutantı, adaptör kendi kendine bağlanması için Vendor Q, N, A ve T'den T4 DNA Ligazlarıyla karşılaştırıldı. Tüm genom DNA kütüphanelerini oluşturmak için 0 ng ve 0,5 ng parçalanmış sığır gDNA'sının girdi olarak kullanıldığı Yeasen DNA Kütüphanesi İnşa Kiti (Cat#12927ES) kullanıldı.

Şekil 5 0 ng (sol) ve 0,5 ng (sağ) gDNA Girişi ile Adaptör Kendi Kendine Bağlanma Verileri

Sonuçlar:

1) Adaptör Kendi Kendine Bağlanma Oranı (0 ng gDNA): Satıcı N > Yeasen > Satıcı T > Satıcı A > Satıcı Q.

2) Adaptör Kendi Kendine Bağlanma Oranı (0,5 ng gDNA): Yeasen > Satıcı T > Satıcı Q ≈ Satıcı N > Satıcı A.

Bize Ulaşın

Yeasen, termal stabilite, kütüphane verimi ve adaptör kendi kendine ligasyonunda mükemmellik gösteren bir T4 DNA ligaz ürünü sunarak geleneksel T4 DNA ligazlarının sınırlamalarını başarıyla aştı. Bu süreçte şirket, araştırmacılara farklı deneysel ihtiyaçları karşılamak için çeşitli seçenekler sunan zengin bir mutant kütüphanesi biriktirdi. Ürünlerimizle veya T4 DNA ligaz mutantlarımızla ilgileniyorsanız, lütfen aşağıdaki yöntemlerle bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin.

E-posta: order1@yeasen.com (BİZ)

Telefon: +1 240-472-6069 (ABD)

Ayrıca Yeasen, bir dizi T4 DNA ligase ürün serisi sunmaktadır. Ürün bilgisi hakkında bilgi almak için ürün bağlantısına tıklayın

Referanslar

[1] Shuman S .DNA Ligazları: İlerleme ve Beklentiler[J].Biyolojik Kimya Dergisi, 2009, 284(26):17365-17369.