RNase HII, RNase H2 olarak da bilinir, çift sarmallı bir DNA heliksinin içinde yer alan tek bir ribonükleotidin 5' ucundaki fosfodiester bağını spesifik olarak hedef alan ve kesen bir endoribonükleazdır ve 5' fosfat ve 3' hidroksil grubu üretir (Şekil 1). Bu enzim, tek sarmallı RNA'ya karşı minimal kesme aktivitesi gösterir ve hem çift sarmallı DNA'ya (dsDNA) hem de tek sarmallı DNA'ya (ssDNA) karşı etkisizdir. 50°C ila 75°C sıcaklık aralığında işlevsel olarak aktif olan RNase HII, 70°C ila 75°C arasındaki sıcaklıklarda en yüksek performansa ulaşır. dsDNA veya ssDNA'yı etkilemeden, bir ribonükleotidin entegre edildiği DNA bölgelerinde hedeflenen, tek bölgeli kesmeyi gerçekleştirme konusundaki benzersiz yeteneğinden yararlanan RNase HII, primer aktivasyonu ve uzantısı dahil olmak üzere reaksiyon başlatma için hassas bir "tetikleyici" görevi görerek spesifik amplifikasyon elde eder. Bu enzim, RNase H'ye bağlı PCR'de (rhPCR), döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) teknolojisinde ve Okazaki parçalarındaki RNA bileşenlerinin bozunmasında önemli bir rol oynar.

一. RNase H -bağımlı PCR(rhPCR)
rhPCR, RNase HII ve özel olarak tasarlanmış, kapalı ayrılabilir rhPCR primerlerini PCR sürecine dahil eder. Bu yaklaşım, RNase HII'nin DNA-RNA hibritleri içindeki RNA'yı seçici olarak hidrolize etme ve tek sarmallı veya çift sarmallı DNA ve RNA'daki fosfodiester bağlarını sağlam bırakma konusundaki benzersiz özelliğinden yararlanır. Sonuç olarak, RNase HII yalnızca DNA-RNA hibritini sindirir ve primer hedef DNA dizisine mükemmel şekilde tamamlayıcı olduğunda primer uzantısına izin verir. Bu hedefli eylem, reaksiyonun doğruluğunu önemli ölçüde artırır. RNase HII, ribonükleik asidin 5' ucunda keserek mutasyonlara neden olmadan ribonükleotidlerin hassas bir şekilde çıkarılmasını başlatabilen tek enzimdir. Yüksek özgüllüğü, hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği nedeniyle rhPCR, tek nükleotid polimorfizmi (SNP) tespiti, gen tiplemesi, birden fazla hedefin eş zamanlı tespiti ve çevresel nükleik asit analizi gibi uygulamalarda belirgin avantajlar sunar.

Teknik Rota

1. Primer Tasarımı

Primer tasarımı, primerin PCR döngüleri sırasında şablona stabil bir şekilde bağlanmasını sağlamak için kesme işleminden sonraki erime sıcaklığının tavlama sıcaklığından daha yüksek olmasını sağlamalıdır. rhPCR primeri üç bölümden oluşur:

1)5' DNA segmenti: Standart PCR primerlerine göre uzunluk ve erime sıcaklığı (Tm) gereksinimleri açısından karşılaştırılabilir, RNase HII enzimi tarafından kesildikten sonra şablon DNA ile etkili bir şekilde eşleşebilir ve uzayabilir.

2）Tek bir RNA bazı: RNase HII için bir kesme alanı sağlar.

3）3' DNA segmenti: Genellikle kısa, uzayamayan bir molekül olan, örneğin propilen glikol gibi bir bloker içeren, dört veya beş bazlık bir uzunluk. Bloker kaldırılıncaya kadar DNA polimerazın uzamasını engeller.

2.Kesme ve Uzatma

rhPCR reaksiyonunun başlangıcında primer ve şablon DNA serbesttir. Primer spesifik RNA:DNA heterodupleks şablonuna bağlandığında, bloke edilen primerin RNA baz 5' tarafı RNase HII enzimi tarafından tanınır ve kesilir, 3'-hidroksil grubu olan bir DNA oligonükleotidi bırakır ve DNA polimerazının uzaması için bir başlangıç ​​noktası sağlar. Bunu geleneksel PCR amplifikasyon süreci takip eder.

Şekil 2. rhPCR prensibinin diyagramı ^[1]

Adam.Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP)

Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), kısa bir sürede izotermal koşullar altında nükleik asitleri çoğaltabilen gen çoğaltımı için basit ve hızlı bir yöntemdir. Ancak, oda sıcaklığında hazırlama sırasında DNA polimeraz aktivitesinin başlaması nedeniyle, az miktarda yanlış eşleşmeye ve primer dimerlerine yol açabilen, yanlış pozitiflere yol açabilen küçük kontaminasyonlara neden olabilen spesifik olmayan uyumsuzluklar oluşur.
RNase HII'yi LAMP amplifikasyon sistemine uygulamak, LAMP teknolojisindeki yanlış pozitifler sorununu etkili bir şekilde çözebilir ve klinik teşhislerdeki uygulamasını genişletebilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, RNase HII kullanan primerle aktive edilen LAMP yöntemi (PA-LAMP), primer hedef ssDNA ile eşleştiğinde, RNase HII enzimi primer üzerindeki RNA'yı spesifik olarak keser, onu aktive eder ve primerin uzamasına izin verir, spesifik amplifikasyon elde eder ve sistemdeki yanlış pozitifleri etkili bir şekilde azaltır.

YEASEN RNaz HII

YEASEN'in RNase HII'si (Kedi#14539) türetilmiştir Pyrococcus abyssi, Pensilvanyave kirletici nükleazlardan, çentik enzimlerinden ve RNase kalıntılarından arındırılmış olup, düşük konak DNA kontaminasyonu ile sistemdeki yanlış pozitifleri etkili bir şekilde azaltır. YEASEN'in RNase HII'si son derece ısıya dayanıklıdır, 95°C'de 30 dakikadan sonra bile aktivitesini korur, bu da onu çeşitli rhPCR reaksiyon sistemleriyle uyumlu hale getirir ve ayrıca LAMP ve diğer uygulamalar için de uygundur.

1. E. coli genomik DNA kalıntısı < 0,5 kopya/100 U

Tespiti E. koli basili RNase HII'nin farklı gruplarındaki genomik DNA kalıntıları, YEASEN'in RNase HII'sinin konak genomik DNA kalıntısının 0,5 kopya/100 U'nun çok altında olduğunu gösterdi.

Şekil 4. Tespiti E. koli basili genomik DNA kalıntısı

2. 95°C Isıya Dayanıklılık Testi

RNase HII'yi 95°C'de 0 ila 45 dakika ısıttıktan sonra, RNase HII'nin enzim aktivitesi test edildi. Sonuçlar, YEASEN'in RNase HII'sinde 45 dakikalık ısıtmadan sonra bile neredeyse hiç enzim aktivitesi kaybı olmadığını gösterdi.

Şekil 5. 95°C ısıya dayanıklılık testi

3. Ekzonükleaz, Nicking Enzimi veya RNase Kalıntısı Yok (1 U Doz)

Farklı RNase HII partilerinin 1 U'su, ilgili substratları DNA/RNA ile 37°C'de 4 saat inkübe edildiğinde, agar jel elektroforezi sonuçları RNase HII'de ekzonükleaz, çentik enzimi veya RNase kalıntısı olmadığını gösterdi.

Şekil 6.Ekzonükleaz, çentik enzimi ve RNaz kalıntısının tespit sonuçları

Önerilen İlgili Ürünler

Ürün Uygulaması	Ürün Adı	Katalog Numarası
rhPCR、LAMBA	RNaz HII(2 U/μL) RNase HII, Gliserol içermeyen (2 U/μL)	14539ES 14541ES
rhPCR	Hieff® Taq DNA Polimerazı	10101ES
RT-LAMBA	Hieff® Bst Plus DNA Polimeraz (40 U/μL)	14402ES
	Hifair® Ⅲ Ters Transkriptaz	11111ES

Referanslar

[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. RNase H-bağımlı PCR (rhPCR): bloke edilmiş ayrılabilir primerler kullanılarak geliştirilmiş özgüllük ve tek nükleotid polimorfizmi tespiti. BMC Biotechnol. 2011 Ağu 10;11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.

[2] Du WF, Ge JH, Li JJ ve diğerleri. Primerle aktive edilebilen ilmek aracılı izotermal amplifikasyon (PA-LAMP) ile tek nükleotid mutasyonunun tek adımda, yüksek özgüllükle tespiti[J].Analytica chimica acta, 2019(1050-):1050.DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068.