Şekil 1. Mg varlığında DNase I'in dsDNA'yı kesmesinin şematik diyagramı²⁺ ve Mn²⁺

Ortak DNase I, öncelikle sığır pankreasından saflaştırılır veya rekombinant bir enzimdir. Sığır pankreasından saflaştırılan DNase I ile karşılaştırıldığında, rekombinant DNase I nispeten daha düşük endojen RNase seviyelerine sahiptir veya RNase içermeyen ürünler olarak formüle edilebilir, bu da onu RNA örneklerinden DNA'nın çıkarılması gibi RNase'ye duyarlı uygulamalar için daha uygun hale getirir.

Uygulamalar

Uygulamalar açısından, DNase I, DNA'dan arındırılmış RNA'yı çıkarma, ters transkripsiyondan önce gDNA'sız RNA şablonları hazırlama ve in vitro transkripsiyondan sonra DNA şablonlarını parçalama gibi RNA bütünlüğünün korunmasıyla ilgili deneylerde kullanımıyla iyi bilinmektedir. Ek olarak, rRNA çıkarılmasında DNA problarını sindirmek, nick çevirisi yoluyla DNA etiketlemek, ayak izi yöntemi kullanılarak DNA-protein etkileşimlerini analiz etmek, rastgele DNA kütüphaneleri oluşturmak, hücre lizatlarının veya protein özütlerinin viskozitesini azaltmak, hücre kültüründe bir katkı maddesi olarak hücre yapışmalarını sindirmek ve apoptoz tespiti için TUNEL analizlerinde pozitif kontrol olarak genomik DNA'yı kısmen kesmek için kullanılabilir. Özetle, DNase I, DNA'nın enzimatik sindirimini gerektiren hemen hemen her uygulamada kullanılabilir. Aşağıda, birkaç yaygın uygulamaya ilişkin kısa bir giriş sağlanacaktır.

• RNA ekstraksiyonu veya ters transkripsiyondan önce gDNA'nın çıkarılması

Laboratuvarlarda yaygın olarak incelenen bir örnek olan RNA, kendi kalitesi nedeniyle deneysel verilerin kalitesini büyük ölçüde etkiler. RNA çıkarma işlemi sırasında gDNA kalıntısını tamamen önlemek genellikle imkansızdır. Bu nedenle, zorlu alt akış uygulamaları (mRNA ekspresyon analizi, transkriptom analizi vb. gibi) yürütmeden önce, genellikle RNA örneklerinin kalıntı gDNA'yı sindirmek için DNase I ile işlenmesi önerilir. gDNA'nın sindirimi, RNA çıkarma sırasında, RNA çıkarmadan sonra veya RNA ters transkripsiyonundan önce gerçekleştirilebilir.

Şekil 2. DNase I tabanlı gDNA çıkarma işlemi

• In vitro transkripsiyonda şablon DNA'nın çıkarılması

In vitro transkripsiyon (IVT), öncelikle uygun substratlar ve tamponların etkisi altında RNA üretmek için bir şablon olarak DNA kullanır. Bu işlemde yaygın olarak kullanılan RNA polimerazları arasında RNA sentezini katalize etmekten sorumlu olan T7, T3 ve SP6 bulunur. Ancak, sentezlenen RNA ürünü DNA kalıntıları içerebilir ve bu kalıntıların ortadan kaldırılması, aşağı akış deneyleri için faydalıdır.

Özellikle mRNA aşılarının geliştirme sürecinde bu DNA kalıntılarının uzaklaştırılması, sonraki saflaştırma süreçlerinin zorluğunu ve nihai ürünün saflığını doğrudan etkileyen kritik bir adımdır.Şablon DNA'yı etkili bir şekilde ortadan kaldırmak için, RNA örneğinin DNA kalıntılarından arınmış olduğundan emin olmak amacıyla genellikle DNase I kullanılır; bu, deneyin genel doğruluğunu ve verimliliğini artırmaya yardımcı olan bir adımdır.

Şekil 3: Şablon olarak doğrusallaştırılmış plazmid kullanılarak in vitro transkripsiyon süreci^[4]

• RNA kütüphanesi inşası ve dizilemesinde rRNA'nın çıkarılması

Organizmalarda rRNA oldukça bol ve oldukça korunmuştur, bu da biyolojik bilgi araştırmaları elde etmek için pek önemli değildir. Ancak, deneyler sırasında çıkarılan toplam RNA'nın %95'i insan rRNA'sıdır ve bu rRNA'ların varlığı hedef RNA'ların tespitini engelleyebilir. Bu nedenle, RNA kütüphanesi hazırlama ve dizilemede, rRNA genellikle önce çıkarılır. Şu anda, rRNA çıkarma için ana yöntem RNAaz sindirimidir ve ana operasyonel adımlar ve prensipler şu şekildedir:

1. Toplam RNA'yı çıkarın;
2. Tek sarmallı DNA problarını rRNA molekülleriyle melezleştirin (Not: rRNA'ya özgü tek sarmallı DNA problarını tasarlayın ve sentezleyin);
3. RNase H, hibridize edilmiş rRNA'yı parçalar;
4. DNase I, DNA problarını parçalar;
5. rRNA başarıyla kaldırılır ve geride rRNA olmayan RNA şablonları kalır.

Şekil 4: Enzimatik yönteme dayalı rRNA uzaklaştırma ilkesinin şematik diyagramı^[5]

• DNA etiketleme için Nick çevirisi

Nick çevirisi, laboratuvarda deoksiribonükleik asit problarını etiketlemek için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu yöntem, DNase I ve E. coli bakterisi DNA Polimeraz I.

Temel prensip şudur:

1. Öncelikle, etiketlenecek çift sarmallı DNA'nın her bir sarmalında birkaç tek sarmallı çentik oluşturmak için uygun konsantrasyonda DNase I kullanın ve çentik yerlerinde 3' hidroksil uçları oluşturun.
2. Daha sonra, 5'→3' ekzonükleaz aktivitesini kullanın koli basiliDNA Polimeraz I, çentiğin 5' ucundan bir nükleotidi çıkarırken, 5'→3' polimeraz aktivitesi E. koli basili DNA Polimeraz I, onu onarmak için çentiğin 3' ucuna etiketli bir nükleotid sokar. Çentik DNA ipliği boyunca hareket ettikçe, etiketli nükleotidler yeni sentezlenen DNA ipliğine dahil edilir.

Şekil 5: Nick çevirisiyle DNA etiketleme ilkesinin şematik diyagramı^[6]

• DNase I ayak izi deneyi

DNase I ayak izi testi, DNA molekülleri üzerindeki DNA bağlayıcı proteinlerin bağlanma bölgelerini belirlemek için kesin bir yöntemdir. Prensip, bir DNA parçasına bağlanan proteinlerin bağlı bölgeyi DNase I tarafından parçalanmaktan korumasıdır. Enzimatik sindirimden sonra, kalan parça ("ayak izi") dizisini belirlemek için kullanılabilir. Jel görüntüsünde, proteinin bağlandığı bölgelere karşılık gelen bantlar yoktur.

Temel prensip şudur:

1. Test edilecek çift sarmallı DNA molekülünün tek sarmallı uçlarını etiketleyin.
2. Proteini DNA ile karıştırın ve enzimatik sindirim için uygun miktarda DNase I ekleyin, böylece farklı uzunluklarda DNA parçaları oluşturun.Enzim miktarı, bitişik DNA parçalarının yalnızca bir nükleotid farklılığına sahip olacak şekilde kontrol edilmeli ve paralel olarak protein eklenmemiş bir kontrol eklenmelidir.
3. DNA'dan proteini çıkarın, denatüre DNA'yı PAGE elektroforezi ile ayırın ve ayak izi bölgesinin nükleotid dizisini kontrol grubuyla karşılaştırarak yorumlamak için otoradyografi çekin.

Şekil 6: DNase I ayak izi analizinin prensibinin şematik diyagramı^[7]

The DNaz I Yeasen Seçim Rehberi

Çeşitli uygulama ihtiyaçlarını karşılamak için Yeasen şunları sunar: rekombinant DNaz I içinde E. koli basilive in vitro mRNA transkripsiyonu ve diğer uygulamaların gereksinimlerini karşılamak için GMP sınıfı DNase I sağlayabilir.

Ürün konumlandırma	Başvuru	Ürün adı	katalog numarası
RNaz içermez	RNA ve protein preparatlarından DNA'nın çıkarılması	Rekombinant DNase I (RNase içermeyen)	10325ES
GMP kalitesinde, RNaz içermez	mRNA'nın in vitro transkripsiyonu	UCF.ME® Deoksiribonükleaz I (DNase I) GMP sınıfı	10611ES

Referanslar

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L, ve diğerleri. Baş ve boyun kanserlerinde HPV DNA, E6/E7 mRNA ve p16INK4a tespiti: sistematik bir inceleme ve meta-analiz[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, ve diğerleri. Servikal örneklerde onkojenik HPV tipi spesifik viral DNA yükü ve E6/E7 mRNA tespitinin karşılaştırılması: çok merkezli bir çalışmadan sonuçlar[J]. Tıbbi viroloji dergisi, 2013, 85(3): 472-482.

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky L S. Kantitatif RNA-PCR'de kullanım için RNA'dan kirletici DNA'nın Dnaz I ile uzaklaştırılmasının optimizasyonu[J]. Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020.

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. Kliniklere çeviriyi mümkün kılmak için in vitro transkripsiyonlu mRNA'nın (IVT mRNA) ilerlemeleri[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2023, 199: 114961.

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R, ve diğerleri. RNA bozunumu olmadan DNase I'in geri döndürülemez ısı inaktivasyonu[J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 252-256.

[6] Adolph S, Hameister H. Biyotin etiketli d-UTP ile metafaz kromozomlarının yerinde nick çevirisi[J]. İnsan genetiği, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C, Zhang S, Huang H. Mikrobiyal genomlardaki replikasyon kökenlerinin tanımlanması için uygun bir yöntemin seçilmesi. Ön Mikrobiyoloji, 2015, 6: 1049.