İzotermal amplifikasyon teknolojisi, sabit sıcaklık koşulları altında belirli nükleik asit dizilerini çoğaltma amacına ulaşabilir. Özel ekipman gerektirmemesi, kısa çoğaltma süresi ve yüksek hassasiyet özellikleri nedeniyle, yerinde tespit ve bakım noktasında tanıda iyi uygulama beklentileri göstermiştir ve moleküler tanı araçlarının geliştirilmesi için oldukça uygundur.

Artan suşlar ve bulaşıcılık ile yeni koronavirüs pandemisi bağlamında, İzotermal amplifikasyon teknolojisi yeni koronavirüsü tespit edebilir Geleneksel PCR tekniklerinin uzun tespit süresi ve tespit ekipmanı ve reaktifleri için yüksek gereksinimler nedeniyle bazı COVID-19 hastalarının hızlı bir şekilde doğrulanamaması sorununu basit cihazlarla hızla çözmeye yardımcı oluyor. Peki izotermal amplifikasyon tekniklerinden biri olan RT-LAMP'ın prensibi nedir? Yeasen'in sağlayabileceği yüksek kaliteli hammaddeler nelerdir?

1. RT-LAMP’ın çalışma prensibi nedir?
2. RT-LAMP için primer tasarımı
3. Yeasen hangi hammaddeleri temin edebilir?
4. Ürün Seçim Rehberi

1. RT-LAMP’ın çalışma prensibi nedir?

2000 yılında Japon bilim insanları Notomi ve diğerleri, döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) adı verilen yeni bir nükleik asit amplifikasyon teknolojisi kurdular. LAMP, hedef genin 6 bölgesi için tasarlanmış 4 spesifik primer kullanır ve izotermal koşullar altında (60～65 ℃) onlarca dakika içinde hedef dizinin 109 kopyasını çoğaltmak için iplik yer değiştirme DNA polimerazını kullanır. Sonuçlar agar jel elektroforezi ile değerlendirildi ve pozitif sonuçlar merdiven şeklinde bantlar gösterdi. LAMP, güçlü özgüllük, yüksek hassasiyet, hızlı ve basit çalışma ve düşük maliyet özelliklerine sahiptir. Bu teknolojinin sürekli iyileştirilmesi ve mükemmelleştirilmesiyle, şu anda çeşitli patojenik mikroorganizmaların tespitinde kullanılmaktadır.

RT-LAMP, LAMP amplifikasyon sistemine ters transkriptaz eklenerek viral RNA'nın doğrudan tespitini gerçekleştirebilen bir yöntemdir. LAMP'nin amplifikasyon verimliliği son derece yüksektir, bu nedenle büyük miktarda nükleik asit yalnızca az miktarda cDNA ile çoğaltılabilir. Nükleik asit amplifikasyon sürecinde ters transkripsiyon süresinden tasarruf edilir ve RNA'nın tespit hızı hızlandırılır.

DNA yaklaşık 65℃'de dinamik bir denge halindedir. Zincir yer değiştirme DNA polimerazının etkisi altında, FIP primerinin F2 segmentinin 3' ucundan başlayarak, zincir yer değiştirme DNA sentezini başlatmak için şablon DNA'nın tamamlayıcı dizisiyle eşleştirilir. F3 primeri, F2c'nin ön ucunda F3c'ye tamamlayıcıdır ve DNA'sını sentezlemek için başlangıç ​​noktası olarak 3' ucunu alırken, öncü FIP primeri tarafından sentezlenen DNA zincirini bir zincir yer değiştirme DNA polimerazının etkisiyle değiştirir. İleriye doğru uzatın. Son F3 primeri tarafından sentezlenen DNA zinciri, bir şablon DNA zinciriyle çift zincir oluşturur. FIP primeri tarafından sentezlenen DNA zinciri, tek bir zincir oluşturmak için F3 primer zinciriyle değiştirilir. Bu tek zincir, 5' ucunda tamamlayıcı F1c ve F1 segmentlerine sahiptir, bu nedenle dairesel bir yapı oluşturmak için öz-baz eşleşmesi gerçekleştirilir. Ve BIP primeri tek zincirle hibritleştirilerek birleştirilir ve BIP primerinin 3' ucu tamamlayıcı bir zincir sentezlemek için başlangıç ​​noktası olarak kullanılır ve bu işlem sırasında yapı açılır.Daha sonra, BIP primerinden F3 ve B3'e benzer primerler eklenir, baz tamamlayıcı eşleşme gerçekleştirilir ve başlangıç ​​noktası olarak 3' ucundan yeni bir tamamlayıcı zincir sentezlenir. Değiştirilen tek zincirli DNA'nın her iki ucunda tamamlayıcı diziler bulunur ve dairesel bir yapı oluşturmak için kendi baz eşleşmesi meydana gelir, böylece tüm zincir halter benzeri bir yapı sunar. Bu yapı, RT-LAMP yönteminin amplifikasyon döngüsünün başlangıç ​​yapısıdır.

Halter şeklindeki yapıda, DNA uzantısı, başlangıç ​​noktası olarak 3' ucundaki F1 segmentini kullanarak ve kendisini şablon olarak kullanarak gerçekleştirilir. Ve FIP primeri F2, döngüdeki tek sarmallı F2c ile hibritleşerek yeni bir sarmal yer değiştirme reaksiyonu turu başlatır. F1 segmentinden sentezlenen çift sarmallı nükleik asit ayrışır ve benzer şekilde nükleik asit üzerinde dairesel bir yapı oluşur. Dairesel yapı üzerinde B2c'nin tek sarmallı bir formu vardır ve BIP primeri üzerindeki B2, yeni bir amplifikasyon turu başlatmak için onunla hibritleşir ve aynı işlemle dairesel bir yapı oluşur. Bu işleme göre, aynı sarmal üzerindeki tamamlayıcı diziler eşleşme, sarmal uzaması ve son olarak farklı boyutlarda yapılar oluşturur.

2. RT-LAMP için primer tasarımı

Primer tasarımı, RT-LAMP'ın başarılı bir şekilde çoğaltılması ve saptanmasının anahtarıdır. RT-LAMP primerleri iki dış primer (F3 ve B3) ve iki iç primer (FIP ve BIP) içerir. F3 primeri: F3 bölgesinden oluşan yukarı akış dış primeri, hedef genin F3c bölgesine tamamlayıcıdır. FIP primeri: F2 bölgesinden oluşan yukarı akış iç primeri, F2 bölgesindeki hedef genin 3' ucundaki F2c bölgesi, hedef genin 5' ucundaki F1c bölgesine tamamlayıcıdır. BIP primeri: B2 bölgesinden oluşan aşağı akış iç primeri, B2 bölgesi, hedef genin 3' ucundaki B2c bölgesine tamamlayıcıdır ve hedef genin 5' ucundaki B1c bölgesi ile aynı diziye sahiptir.

PCR'ye benzer şekilde, primer tasarım prensipleri baz bileşimi, GC içeriği ve alt yapı gibi faktörlere dikkat etmelidir. Ek olarak, aşağıdaki noktalara dikkat edilmelidir. İç primerler FIP ve BIP'nin 5' uç kısımları, yani F1c ve B1c, genellikle 8-50 bp uzunluğundadır. Uzunluk tercihen 15 ila 25 bp'dir ve Tm değeri 3' uç kısmındaki F2 ve B2'nin Tm değerlerinden daha büyüktür. İç primerler FIP ve BIP'nin 3' uç kısımları, yani F2 ve B2, genellikle 8-50 bp uzunluğundadır. Uzunluk tercihen 15-25 bp'dir ve Tm değeri deneyde seçilen Bst DNA polimerazının optimum sıcaklığıyla tutarlıdır. Dış primerler F3 ve B3'ün uzunlukları genellikle 8-50 bp'dir. Uzunluk tercihen 15-25 bp'dir ve Tm değeri F2 ve B2'ninkinden daha küçüktür. Primerler tasarlanırken, döngü yapısı ve hedef dizinin boyutu dikkate alınmalıdır. Döngüdeki baz sayısı 40 bp'den fazla ve hedef dizinin boyutu 130-200 bp olduğunda, amplifikasyon verimliliği en yüksektir.

3. Yeasen hangi hammaddeleri temin edebilir?

3.1 [Yeni yükseltme] Yeasen Bst Artı DNA Polimeraz

Yeni yükseltilen Hieff™ Bst Plus DNA Polimeraz (Kategori #14402ES, 14403ES) Bacillus stearothermophilus'un DNA polimeraz geninin ifade edilmesi ve saflaştırılmasıyla elde edilir tür E.coli'de 5′→3′ ekzonükleaz alanından yoksun.Enzim zincirinin yer değiştirme kabiliyeti güçlüdür ve yüksek hassasiyet, yüksek amplifikasyon verimliliği ve yüksek dUTP toleransı avantajlarına sahiptir ve izotermal amplifikasyon teknolojisine dayalı patojenlerin gerçek zamanlı tespitinde yaygın olarak kullanılabilir.

3.1.1 Hızlı ve yüksek hassasiyet

Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polimerazı yüksek hassasiyete sahiptir ve hedef geni 5 kopya kadar düşük bir değerde tespit edebilir. Şablon miktarı femtogram (fg) seviyesindedir ve amplifikasyon oranı rakip ürünlerden daha hızlıdır.

Şekil 1. RT-LAMP reaksiyonu Yeasen ile gerçekleştirildi Hieff™ Bst Plus DNA Polimerazı (Turuncu) ve SARS-CoV-2'yi çoğaltmak için rakip N (Gri) ve rakip T'nin (Mavi) Bst enzimleri. Sonuçlar, Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polimerazı'nın her zaman rakip ürünlerden daha hızlı eşiğe ulaşabileceğini ve çoğaltma oranının daha hızlı olduğunu göstermektedir.

4. Ürün Seçim Rehberi

Yeasen'in sağladığı ürünler şunlardır:

Tablo 1.Ürün bilgisi