Spesifik olmayan amplifikasyonun azaltılmasına yardımcı olmak için çift blok anti-TAQ DNA polimeraz antikoru

Moleküler tanı, IVD alanında en hızlı gelişen alt alandır. Kısa tespit süresi, yüksek duyarlılık ve güçlü özgüllük avantajlarına sahiptir. Tümör eş zamanlı tanısında ve bulaşıcı hastalıkların ve genetik hastalıkların taranmasında yaygın olarak kullanılır. Moleküler tanı alanında, PCR yalnızca en büyük pazar payına sahip en olgun teknoloji platformu değil, aynı zamanda klinik tanının "altın standart" teknolojisidir. Geleneksel PCR reaksiyonunda, genellikle spesifik olmayan amplifikasyon sorunu ortaya çıkar. Spesifik olmayan amplifikasyon, tespit sonuçlarının yorumlanmasını doğrudan etkiler ve amplifikasyon duyarlılığının ve hatta hedef parçaların veriminin düşmesine yol açacaktır. Spesifik olmayan amplifikasyon nasıl oluşur ve etkili bir şekilde nasıl önlenebilir?

1. Geleneksel DNA Polimerazı Spesifik Olmayan Amplifikasyona Yol Açabilir

2. Sıcak Başlangıç ​​Polimerazı Amplifikasyon Spesifitesini İyileştirebilir

3. Çift Bloklu Taq Antikoru Amplifikasyon Spesifitesini ve Stabilitesini İki Katına Çıkarabilir

4. Yeasen'in Çift Blok Taq'ının Performans Gösterimi antikor

5. Ürün bilgisi

1. Geleneksel DNA Polimerazı Spesifik Olmayan Amplifikasyona Yol Açabilir

Primerlerin zayıf dizi özgüllüğü, özgül olmayan amplifikasyonun doğrudan nedenidir. Geleneksel DNA polimerazının promotörü olarak, ekzonükleaz aktivitesi, primerlerin özgüllüğünü azaltmak için PCR sisteminin hazırlanması sırasında DNA primer dizisini kesebilir.

Ek olarak, geleneksel DNA polimerazı yalnızca ekzonükleaz aktivitesine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda polimeraz aktivitesine de sahiptir. DNA polimerazının optimum uzatma sıcaklığı 72℃ olmasına rağmen, polimeraz oda sıcaklığında hala aktiftir. Bu nedenle, PCR reaksiyonunun hazırlanması ve ilk ısıtma işlemi sırasında, primerler bazı tek zincirli şablonlarla spesifik olmayan bağlanma oluşturabilir ve Taq DNA polimerazının etkisi altında uzayabilir, bu da hedef olmayan dizilerin çoğalmasına ve reaksiyonun özgüllüğünün etkilenmesine neden olabilir.

Bu nedenle, PCR sistemleri genellikle DNA polimeraz aktivitesini inhibe etmek için buz üzerinde yapılandırılır. Bu yöntem basit ve ucuz olmasına rağmen, enzim aktivitesini tamamen inhibe edemez, bu nedenle spesifik olmayan ürünlerin çoğalmasını ortadan kaldıramaz.

2. Sıcak Başlangıç ​​Polimeraz Amplifikasyon Spesifitesini İyileştirebilir

Sıcak başlangıçlı polimeraz, sıcak başlangıçlı PCR'nin temel bileşenidir. Oda sıcaklığında, DNA polimerazın aktif bölgesi bir enzim değiştirici tarafından bloke edilir. Sadece 95℃'de PCR denatürasyonundan sonra, enzim değiştirici düşer ve enzim aktivitesi başlar, enzimin neden olduğu spesifik olmayan amplifikasyon önlenir.

Şu anda, piyasada yaygın olarak kullanılan DNA polimeraz sıcak başlatma modifikasyon yöntemleri esas olarak kimyasal yöntem, ligand yöntemi ve antikor yöntemini içerir. Bunlar arasında, antikor modifiyeli sıcak başlatma polimerazının bloke edici etkisi en iyisidir ve enzim aktivitesinin salınım hızı hızlıdır, bu da PCR'nin reaksiyon süresini büyük ölçüde azaltabilir. IVD pazarında yaygın olarak kullanılan bir sıcak başlatma enzim modifikasyon yöntemidir.

Ancak geleneksel antikor sıcak başlatma yönteminin sadece Taq DNA polimerazının 5'→3' polimeraz aktivitesini bloke ettiği, bu nedenle düşük sıcaklıklarda yanlış uyum veya primer dimerinden kaynaklanan spesifik olmayan amplifikasyonun önlenebileceği unutulmamalıdır.Ancak, yukarıda belirtildiği gibi, Taq DNA polimerazı yalnızca 5'→3' polimeraz aktivitesine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda 5'→3' ekzonükleaz aktivitesine de sahiptir. Bu ekzonükleaz aktivitesi, düşük sıcaklıklarda uyumsuz probların veya diğer materyallerin bozulmasına yol açabilir ve bu da bazı spesifik olmayan sinyallerle sonuçlanabilir.

3. Çift Bloklu Taq Antikoru Amplifikasyon Spesifitesini ve Stabilitesini İki Katına Çıkarabilir

Yerel moleküler enzim endüstrisinde yenilikçi bir lider olarak Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (bundan sonra Yeasen olarak anılacaktır) moleküler enzim hammaddelerinin Ar-Ge ve üretimine odaklanmaktadır ve yenilik yapmaya cesaret etmektedir. Kendi olgun antikor tarama platformuna güvenerek, hedef molekül olarak Taq DNA polimerazı ile bloke edici antikoru tarar. Yıllar süren titiz araştırma ve sistem optimizasyonundan sonra, çift ​​bloklu anti-Taq DNA polimeraz antikoru, Sadece Taq DNA polimerazının polimeraz aktivitesini engellemekle kalmaz, aynı zamanda Taq DNA polimerazının ekzonükleaz aktivitesini de engeller. İki yönlü bir yaklaşımda, sadece uyumsuzluk veya primer dimerinden kaynaklanan spesifik olmayan amplifikasyonu etkili bir şekilde önlemekle kalmaz, aynı zamanda malzeme bozunmasının spesifik olmayan sinyaller üretmesini de önler ve reaktifin kararlılığını iki katına çıkarır.

4. Yeasen'in Çift Blok Taq'ının Performans Gösterimi antikor

4.1 Çift Blok Taq Antikorunun Kullanımı Doğru ve Daha Hassastır

Yeasen'in çift blok antikoruyla Taq polimerazını bloke ettikten sonra ve T firmasının antikoru pozitif çıkan örnekler ARMS-PCR ile tespit edildi.

Şekil 1. ARMS-PCR amplifikasyon eğrisi; Mavi: T şirketinin bloke edici antikoru; Kırmızı: Yeasen'in çift blok antikoru

Şekil 1'de Yeasen çift blok antikoru ile bloke edilen Taq polimerazının ARMS-PCR amplifikasyonunda doğru tipleme ve daha yüksek duyarlılığa sahip olduğu görülebilir.

4.2 Çift Bloklu Taq Antikoru Etkili Bir Şekilde Taq DNA Polimerazının Ekzonükleaz Aktivitesini Bloke Etti

Sentezlenen primer problar, sırasıyla açık ve çift bloklu antikorlarla bloke edilmiş Taq DNA polimerazının reaksiyon çözeltisiyle eşleştirildi ve bunların floresan sinyallerini tespit etmek için 40℃'de reaksiyona sokuldu.

Şekil 2. Ekzonükleaz aktivitesi için çift blok antikorunun bloke etme etkinliğinin tespiti; Sarı: kapatılmamış Taq DNA polimeraz grubu; Mor: Çift bloklu antikor tarafından bloke edilen Taq DNA polimeraz grubu

Şekil 2'den görülebilir Çift bloklu antikorun Taq DNA polimerazının ekzonükleaz aktivitesini etkili bir şekilde bloke edebildiği.

4.3 Çift Bloklu Taq Antikoru, Tespit Reaktifinin Stabilitesini Etkili Şekilde İyileştirebilir

Taq DNA polimerazı sırasıyla geleneksel bloke edici antikor ve çift bloke edici antikor ile bloke edildi ve primer prob içeren tam bir premiks halinde yapılandırıldı. 10000 ASF plazmid kopyası 10 gün boyunca 4℃'de veya 1, 3 ve 5 gün boyunca 37℃'de çoğaltıldı. Amplifikasyon eğrisi ve Ct değeri değişiklikleri gözlemlendi ve geleneksel bloke edici antikor ve çift bloke edici antikorun tam premiks reaksiyon solüsyonunun stabilitesi üzerindeki etkileri karşılaştırıldı.

Şekil 3.Geleneksel bloke edici antikor (a) ve çift bloklu antikor (b) bloke edici reaksiyon çözeltisi ile çoğaltılan 10000 ASF plazmidinin amplifikasyon eğrisi; Mavi: 4℃'de 10 gün saklayın; Kırmızı: 0 gün boyunca 4℃'ye yerleştirildi (kontrol)

Şekil 3'ten görülebileceği gibi, çift bloklu antikor reaksiyon solüsyonunun stabilitesini koruyabilir ve geleneksel bloklama antikorundan daha etkili bir şekilde tespit reaktifinin stabilitesini iyileştirebilir. Primer probu içeren tüm premiks çift bloklu antikorla bloke edildikten ve 10 gün boyunca 4℃'ye yerleştirildikten sonra amplifikasyon eğrisi ve Ct değeri önemli ölçüde değişmedi.

Şekil 4. Geleneksel bloke edici antikor (a) ve çift bloke edici antikor (b) bloke edici reaksiyon çözeltisi ile çoğaltılan 10000 ASF plazmidinin amplifikasyon eğrisi; Mavi: 37℃'de 5 gün saklayın; Yeşil: 3 gün boyunca 37℃; Sarı: 1 gün boyunca 37℃; Kırmızı: 0 gün boyunca 37℃'ye yerleştirildi (kontrol)

Şekil 4'ten görülebileceği gibi, çift bloklu antikor reaksiyon solüsyonunun stabilitesini koruyabilir ve geleneksel bloklama antikorundan daha etkili bir şekilde tespit reaktifinin stabilitesini iyileştirebilir. Çift bloklu antikor primer-probu içeren tüm premiksi bloke eder ve 1, 3 ve 5 gün boyunca 37℃'ye yerleştirildikten sonra Ct değeri farkı 0,2'den azdır.

4.4 Çift Bloklu Taq Antikoru, Temel Çizgi Kayması Sorununu Çözmeye Yardımcı Olur

Bazı primerler belirli bir tampon ve aletlerle işbirliği yaptığında, bazal kayma meydana gelir. Yeasen, bazal problemini iyileştirmek için birçok yöntem denedi ve çift bloklu antikorun kararlı bir bazal için daha elverişli olduğunu buldu.

Şekil 5. N geninin (a) ve ACT geninin (b) amplifikasyon eğrisi; Kırmızı: Geleneksel bloke edici antikor; Yeşil: çift bloklu antikor

Şekil 5'te görülebileceği gibi, spesifik primerler ve tamponlar altında çift bloklu antikorların kullanımı, bazal kayma sorununu çözmeye yardımcı olabilir.

4.5 Çift Blok Taq Antikoru Kullanılarak İyi Doğrusallık Elde Edildi

ASF/ACT çift plazmidinin 100000, 10000, 1000 ve 100 kopyası, çift blok antikoru ile bloke edilen reaksiyon solüsyonuyla çoğaltıldı ve standart eğri oluşturuldu.

Şekil 6. Çift blok reaksiyon çözeltisi tarafından üretilen ASF geninin (a) ve ACT geninin (b) standart eğrileri

Şekil 6'da görülebileceği gibi, standart eğri R2 ASF geninin 0,998'i ve amplifikasyon verimliliği %98,848'dir; Standart eğri R2 ACT geninin genotip ...

4.6 Çift Blok Taq Antikor, Enzim Aktivitesini Hızla Serbest Bırakabilir

Taq polimerazı ithal T şirketinin antikoru ile bloke edildi ve Yeasen'in çift blok antikoru (cat#31303) sırasıyla, ve enzim aktivitesi 95℃'de 20 saniye boyunca ısı şokundan sonra tespit edildi. 31303'ün 95℃'de 20 saniye boyunca ısı şokundan sonra enzim aktivitesinin %95'inden fazlasını serbest bırakabildiği görülebilir, bu da T şirketinin antikoruna eşdeğerdir.

Tablo 1. Enzim Aktivitesi

4.7 Çift Blok Taq Antikor Birçok Taq Enzim Türünü Bloke Edebilir

Üç tip Taq enzimi (vahşi tip ve 2 mutant) Yeasen'in çift blok antikoru (cat#31303) tarafından bloke edildi ve blok oranı 1 μ g: 5 U idi, floresan değeri ve sızdırmazlık etkinliği ölçüldü. Yeasen'in çift blok antikorunun (cat#31303) bloke edici etkisinin farklı tipteki Taq enzimleri için daha iyi olduğu görülebilir.

Tablo 2. Farklı Taq enzim tiplerinin blokaj etkinliği

4.8 Yeasen'in Çift Blok Taq Antikoru Farelerde Genomik Kalıntıya Sahip Değildi

Negatif kontrol için şablon olarak su ve pozitif kontrol için şablon olarak fare genomu alınarak 31303 farklı parti çoğaltıldı. Hedef parçanın örnekte çoğaltılmadığı bulundu, bu da antikor içinde fare genom kalıntısı olmadığını gösteriyor.

Şekil 7. Fare genom kalıntısı tespit diyagramı

Not: - negatif kontrol, + pozitif kontrol ve 1-5 farklı partilerden 31303 örnektir

5. Ürün bilgisi