Taq DNA polimerazının spesifik olmayan amplifikasyonu, PCR deneylerinde yaygın bir sorundur ve doğrudan tespit sonuçlarının yorumlanmasını etkiler ve amplifikasyon duyarlılığında bir azalmaya ve hatta hedef parçanın veriminde bir azalmaya yol açabilir. Oda sıcaklığında Taq DNA polimerazının aktif merkezini kapatmak için enzim değiştiricileri kullanmak ve böylece oda sıcaklığında Taq enziminin DNA polimeraz aktivitesini inhibe etmek, şu anda spesifik olmayan amplifikasyonu bastırmak için en etkili yöntemdir. Yisheng tarafından geliştirilen çift sızdırmazlık antikorları yalnızca Taq DNA polimerazının polimeraz aktivitesini kapatmakla kalmaz, aynı zamanda Taq DNA polimerazının ekzonükleaz aktivitesini de aynı anda kapatır. Bu çift yaklaşım, yanlış eşleşme veya primer dimerlerinden kaynaklanan spesifik olmayan amplifikasyonu etkili bir şekilde önler ve ayrıca malzeme bozulması nedeniyle spesifik olmayan sinyallerin oluşmasını önler, böylece reaktifin özgüllüğünü iki katına çıkarır. Bu, tespit reaktiflerinin nakliye veya oda sıcaklığında kullanımla kolayca başa çıkmasını sağlar.

1.Ultra yüksek amplifikasyon özgüllüğü—Çift mühürlü antikor, aynı anda hem polimeraz hem de ekzonükleaz aktivitelerini mühürleyebilir, böylece nonspesifik amplifikasyondan etkili bir şekilde kaçınılabilir ve özgüllük artırılabilir.

2.Olağanüstü tespit hassasiyeti—Sıcak başlatma formülasyonu, düşük miktarda bulunan genlerin etkili bir şekilde tespit edilmesini sağlayarak daha yüksek hassasiyet sunar.

3.Üstün ürün kararlılığı—37°C'de 5 gün veya 4°C'de 10 gün bekletildiğinde performansı kararlıdır.

4.Temel kararlılık ve iyi doğrusallık—Temel kayma sorununu ele alarak mükemmel doğrusallık elde edilir.

5.Hızlı enzim aktivitesi salınımı—Enzim aktivitesinin %95'inden fazlası 95°C'de 20 saniye ısıtılarak salınabilir.

6.Enzimlerin geniş uygulanabilirliği—Hem doğal tip hem de mutant Taq enzimleri için uygundur, her mg antikor 4-10 KU Taq enzimini mühürleme kapasitesine sahiptir.

1 Taq DNA polimeraz ekzonükleaz aktivitesinin bloke edilmesi

Sentetik primer problar sırasıyla, mühürlenmemiş veya çift-kapalı antikorlarla mühürlenmiş Taq DNA polimerazının reaksiyon karışımlarına dahil edildi ve reaksiyonlar 40°C'de gerçekleştirildi. Her ikisinin de floresan sinyalleri tespit edildi ve çift-kapalı antikorların Taq DNA polimerazının ekzonükleaz aktivitesini etkili bir şekilde mühürleyebildiği bulundu.

Şekil 2. Çift mühürlü antikor-endonucleaz aktivitesinin mühürleme etkinliğinin tespiti.

02 Algılama hassasiyeti doğrulaması

Sırasıyla Yeasen'in çift mühürlü antikoru ve T Şirketi'nin Taq enzimini mühürleyen antikoru kullanılarak, ardından pozitif örneklerin ARMS-PCR teknolojisi ile tespiti sonucunda, Yeasen'in çift mühürlü antikoru ile mühürlenen Taq enziminin, ARMS-PCR amplifikasyonunda daha yüksek hassasiyetle doğru sonuç verdiği bulundu.

Kırmızı:YEASEN antikoru+Taq; Mavi:tedarikçi A antikoru+Taq.

Şekil 3. ARMS-PCR'nin amplifikasyon eğrisi.

03 Stabilite Doğrulaması (10 gün boyunca 4°C, 5 gün boyunca 37°C).

Taq DNA polimerazını bloke etmek için geleneksel kapalı antikorlar ve çift kapalı antikorlar kullanılarak, polimeraz daha sonra primerler ve problar içeren tam bir ön karışım solüsyonuna formüle edilir. Bu solüsyon 10 gün boyunca 4°C'de veya 1, 3 ve 5 gün boyunca 37°C'de bırakılır ve daha sonra ASF plazmidinin 10.000 kopyasını çoğaltmak için kullanılır. Çoğaltma eğrilerinde ve Ct değerlerinde önemli bir değişiklik olmadığı gözlemlenmiştir.

Şekil 4. Taq polimerazı geleneksel bloke edici antikor (A) ve çift bloke edilmiş antikor (B) ile bloke edildikten sonra 10.000 kopya ASF plazmidinin amplifikasyon eğrileri, qPCR sistemiyle çoğaltılmıştır.

04 Temel Algılama

Belirli primerlerin belirli tamponlar ve aletlerle birlikte kullanıldığı belirli koşullarda, bazal çizgi kayması olarak bilinen bir fenomen meydana gelebilir. Ancak, çift kapalı antikorların kullanımı bazal çizgi kayması sorununu etkili bir şekilde çözebilir ve böylece daha kararlı bir bazal çizginin oluşmasını kolaylaştırır.

Şekil 5. qPCR analizinde SARS-CoV-2 N geni (A) ve ACT geninin (B) amplifikasyon eğrileri.

05 Doğrusallık Doğrulaması

Çift kapalı antikorlarla kapatılan reaksiyon karışımı, standart bir eğri oluşturmak için ASFV/ACT ikili plazmidinin 100.000, 10.000, 1.000 ve 100 kopyasını çoğaltmak için kullanıldı. Şekil 7'de görülebileceği gibi, her ikisi de iyi doğrusallık sergiliyor.

Şekil 6. Çift blok reaksiyon karışımı kullanılarak oluşturulan ASFV geni ve ACT geni için standart eğri grafikleri.

06 Enzimatik Aktivite Salınım Testi

Yeasen'den çift kapalı antikorlar (Cat#31303) Taq enzimini mühürlemek için kullanılarak ve 20 saniye boyunca 95°C'de termal şoka tabi tutularak enzimatik aktivite tespit edildi. 95°C'de 20 saniyelik termal şoktan sonra 31303'ün enzimatik aktivitenin %95'inden fazlasını serbest bırakabildiği gözlemlenebilir; bu da Şirket T'den gelen antikorlarla karşılaştırılabilir.

Tablo 1. Enzimin 95°C’de 20 saniye boyunca ısı şokuna maruz bırakılması.

07 Multiplex Taq Polimeraz Tespiti

Yeasen'in çift kapalı antikorları (Cat#31303), 1μg ila 5U'luk bir sızdırmazlık oranıyla üç tip Taq polimerazını (vahşi tip + iki mutant tip) mühürlemek için kullanıldı ve floresan değerleri ve mühürleme etkinliği ölçüldü. Farklı Taq polimeraz tipleri için Yeasen'in çift kapalı antikorlarının (Cat#31303) iyi sızdırmazlık etkileri gösterdiği bulundu.

Tablo 2. Farklı Taq polimeraz tiplerinin bloke edilmiş etkinliği.