Tıbbi araştırmalar ilerlemeye devam ettikçe, hedefli tedavi daha da olgunlaştı. Hedefli tedavinin öncülü, kalıtsal bozukluklara veya kötü huylu tümörlere neden olan gen mutasyonlarını belirlemek için ilaçların moleküler hedefleri üzerinde genetik testler yapmaktır. ARMS-PCR, çok sayıda DNA nokta mutasyonunu tespit edebilen PCR tabanlı yeni bir yöntemdir. Şu anda, kanserlerin özelleştirilmiş genetik tanımlanması için en temel ve yaygın yöntemlerden biridir. Terapötik kullanımının faydaları, alan uzmanları tarafından iyi bir şekilde kabul edilmiştir.

1. Alel-spesifik PCR nasıl çalışır?
2. ARMS özgüllüğü nasıl artırılır?
3. Yeasen tarafından sağlanan ürünlerin özellikleri nelerdir?
4. Ürün performans verileri nelerdir?
5. İnsanlar ürünleri nasıl sipariş ediyor?

1. Alel-spesifik PCR nasıl çalışır?

ARMS-PCR, Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi PCR'dir (ARMS-PCR), ayrıca Allele-Spesifik PCR (AS-PCR) olarak da bilinir. Alele özgü uzantı, vahşi tip alel ve mutant vahşi tip geni tanımlamak için düzenlenir ve floresan sinyal değeri Taqman prob tekniği kullanılarak ölçülür.
ARMS PCR primerleri, allelin iki yukarı akış primerinin 3' ucunda farklı nükleotidlerle tasarlanmıştır ve iki primer sırasıyla vahşi tip ve mutant tip için spesifiktir. Amplifikasyon sırasında, şablonla tamamen eşleşmeyen yukarı akış primerleri tamamlayıcı baz çiftleri oluşturamaz, bu da uyumsuzluklara, engellenmiş uzantıya ve PCR ürünleri üretememeye neden olur, oysa şablonla eşleşen primer sistemleri karşılık gelen PCR ürünlerini çoğaltabilir. Taqman probundaki florofor, cihaz tarafından tespit edilebilen bir floresan sinyali yayabilir ve genotip, floresan verilerinin değerlendirilmesiyle doğrulanabilir.
ARMS teknolojisi yüksek hassasiyete sahiptir, tespit sınırı 100 kopya/mL'ye ulaşabilir ve tümör dokusu için tespit sınırı %0,5 mutasyon oranına ulaşabilir. Ayrıca, ARMS zaman alıcı ve düşük maliyetlidir ve sonuçlar sezgiseldir ve değerlendirilmesi kolaydır. Bunun nedeni, qPCR veya elektroforez teknolojisiyle birleştirilen ARMS'nin yalnızca daha az zaman alan bir PCR reaksiyonu gerektirmesidir. MGB probları kullanan gerçek zamanlı PCR teknolojisine kıyasla daha düşük maliyetli ve sezgisel sonuçlara sahip olan ARMS teknolojisi için yalnızca yukarı akış primerlerinin optimize edilmesi gerekir. Parafine gömülmüş doku örneklerinden çıkarılan DNA'nın çoğu parçalanmış olduğundan, doğru tespit sonuçları elde edilemez. ARMS yöntemi, hedef ürünün uzunluğunu en aza indirmek için tasarlanmıştır, böylece parafine gömülmüş dokudaki bu zorluğu ele alır. Aynı zamanda, PCR platformuyla birleştirilen ARMS, çalıştırılması basit olan ve ürün sonrası işleme gerektirmeyen kapalı tüp işlemini gerçekleştirir, böylece amplifikasyon ürünlerinin kontaminasyonunu en üst düzeyde önler.
Teorik olarak, Taq DNA polimerazı, verimli bir polimerizasyon gerçekleştirmek için primerin 3' ucunda kalan şablona tam olarak tamamlayıcı olmalıdır. Ancak, Taq DNA'sının sıkılığı birkaç faktörden etkilenir. Bazı durumlarda, primerin 3' terminal tabanı şablona tamamlayıcı olmasa bile bir uzatma işlemi yapılabilir. 3' ucunda yalnızca bir baz uyumsuzluğu varsa, primerler uyumsuzlaşabilir ve uzatılabilir, ancak uzatma verimliliği düşüktür. Farklı 3' uç çıkıklarının farklı uzatma verimlilikleri vardır. 3' ucuna başka uyumsuz bazlar eklenirse, uyumsuzluk sayısı çok fazladır ve 3' ucu belirli bir seviyeden sonra uzatılamaz.Bu nedenle, primerin 3' ucundaki tek bir baz uyumsuzluğu iki aleli yeterince ayırt edemez ve bu da yanlış pozitif sonuçlara neden olur.

2. ARMS özgüllüğü nasıl artırılabilir?

ARMS özgüllüğünü iyileştirmenin odak noktası primer uzatma özgüllüğünü iyileştirmektir. 3' ucundan 2. veya 3. baza uyumsuz bir baz sokulabilir. Uyumsuz bazlar 3' ucundaki uyumsuz bazlarla birlikte hareket eder ve 3' ucuna tamamlayıcı olmayan şablonda primer amplifikasyon ürünü oranı azalır. Primerler 3' uçlarına tamamlayıcı şablonlarda normal şekilde çoğalırken, primerlerin uyumsuz bazlarının türü 3' ucundaki baz uyumsuzluğunun türüne bağlıdır.
ARMS için spesifik primerler tasarlandıktan sonra, alel-spesifik floresan rezonans enerji transferi için bir çift TaqMan probu gerekir. TaqMan probları iki floresan boyaya sahiptir, 5' ucu bir floresan gendir ve 3' ucu genel bir floresan söndürme genine sahiptir. Tam bir probda, söndürücü gen ve florojenik gen, uzamsal olarak birbirine çok yakındır ve bu da floresan söndürmeyle sonuçlanır. Normal koşullar altında, floroforun 5' ucunda yaydığı floresan tespit edilemez ve yalnızca 3' ucundaki söndürücünün arka plan floresansı tespit edilebilir. Hedef gen amplifikasyonu sürecinde, hem PCR primerleri hem de floresanla etiketlenmiş problar, de-OR sırasında hedef diziye tamamlayıcı olacaktır. Taq enzimi şablon ipliğini uzatırken şablona sabit bir şekilde bağlanmış bir prob ile karşılaştığında, Taq enziminin 5'-3' ekzonükleazı şablona bağlı spesifik probu bozacaktır. Prob üzerindeki florofor fiziksel boşlukla ayrılır, söndürme etkisi kaybolur ve floresans yayılır. Zayıf floresan problar ve hedef diziler arasındaki uyumsuzluklar salınan floresans miktarını azaltacaktır.

Şekil 1 ARMS-PCR'nin temel kavramı

3. Yeasen tarafından sağlanan ürünlerin özellikleri nelerdir?

YEASEN Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix, verimli ARMS-PCR aracılı genotip belirlemeye olanak tanıyan amplifikasyon bloğu konseptine dayalı bir kittir.

👍Yüksek seçicilik: birden fazla gen mutasyonunu tespit edebilme;
👍Yüksek hassasiyet: Mutant primerler 10ng/L DNA'da %0,5 kadar düşük konsantrasyonlarda bile mutasyonları tespit edebilir;
👍Okuması kolay: Sonuçlar açıktır ve nesnel olarak değerlendirildi ve Düz ve karmaşık değildir;
👍Kullanımı kolay: Birçok PCR ekipmanıyla uyumludur, çalışma şekli standarttır ve cihaz üzerindeki tespit 90 dakikada tamamlanabilir.

4. Ürün performans verileri nelerdir?

4.1 Üstün ürün blokaj etkisi

Deney: 5L şablon girişi, 10ng/L vahşi tip şablon ve eşdeğer miktarda mutant plazmid, mutant primerler kullanılarak çoğaltıldı
Site：KRASG13D（38G>A）
Kırmızı：13755；Mavi: Rakipler

Şekil 2, vahşi tip primerlerin hem vahşi tip hem de mutant şablonları çoğalttığını göstermektedir. Amplifikasyon eğrisine göre, vahşi tip şablonun tepe noktası yoktur veya vahşi tip ile mutant arasındaki Ct değeri farkı 6-8'dir, bu da vahşi tip ve mutant genlerin etkili bir şekilde ayırt edilmesini sağlar.

4.2 Ürün tespit oranı %0,05'e kadar ulaşabilir

Deney 1: Kendi kendine karışan standart hazırlama tekniği (%50): 50 μL 10ng/μL vahşi tip DNA ve 50 μL 3X103 mutant plazmid kopyası.
Site：KRASG13D(38G>A)

Şekil 3. Amplifikasyon eğrisine göre ürün %0,05 konsantrasyonda etkili bir şekilde çalışmaya devam ediyor

Deney 2: Satın alınan %5 standart (50ng/μL), kütüphane seyreltici ile 10ng/μL'ye kadar seyreltildi, ardından 10ng/μL 293g DNA ile %0,1 ve %0,05'e kadar daha fazla seyreltildi.
Site：L858R
Kırmızı：13755；Mavi: Rakipler

Şekil 4: Amplifikasyon eğrisine göre, 10ng/μL'lik doğal tip gDNA arka planına karşı lokusların tespit oranı %0,05 kadar yüksek olabilir ve ticari standartlarla yapılan sonraki doğrulama, ürünlerimizin mükemmel bir tespit oranına sahip olduğunu göstermektedir.

4.3 Mükemmel ürün stabilitesi

Ürünün güçlendirici ve bloke edici etkisi 10 kez dondurulup çözülmesinden etkilenmez.
Deney: Kırmızı: -20℃; Yeşil: 5 kez gerçek donma-çözülme; Mavi: 8 kez gerçek donma-çözülme; Mor: 10 kez gerçek donma-çözülme.
Site：L858R

Şekil 5, reaktif 13755'in on kez tekrar tekrar dondurulup çözülmesinin, onun amplifikasyon ve blokaj özellikleri üzerinde bir etkisinin olmadığını göstermektedir.

37 °C sıcaklıkta 7 gün boyunca amplifikasyon ve blokaj etkisi etkilenmez.
Deney: Kırmızı: -20°C; Yeşil ve Mor: 37°C 7 gün boyunca.
Site：L858R

Şekil 6, 37°C'de yedi günün 13755 reaktifinin amplifikasyon ve blokaj etkisi üzerinde hiçbir etkisinin olmadığını göstermektedir.

5. İnsanlar ürünleri nasıl sipariş ediyor?

2014 yılında kurulan Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., alet enzim hammaddeleri ve antijen antikorlarının Ar-Ge ve üretimiyle uğraşan bir yüksek teknoloji kuruluşudur. Ürünleri arasında moleküler tanı enzimleri, proteinler ve ilaçlarda, gıda güvenliği testlerinde, üremede, adalette ve diğer endüstrilerde kullanılan antikorlar yer almaktadır. Yaşam bilimleri alanındaki müşterilerimize yüksek kaliteli ürünler ve hizmetler sunmaya kararlıyız. Yeasen'in sağlayabileceği ürünler şunlardır:

Tablo 1: Yeasen tarafından sağlanan ürünler