Mart 2022'den bu yana, kurnaz Omicron mutant suşu bir kez daha insanların huzurlu hayatlarını bozdu, yeni koronavirüs salgınları ülkenin her yerinde patlak verdi ve 30 ili (özerk bölgeler ve belediyeler) etkiledi. SARS-CoV-2 salgınının kesin önlenmesi ve kontrolünün etkili bir yolu olarak, nükleik asit tespiti normal bir yaşam biçimi haline geldi. "Bugün nükleik asit testini yaptırdın mı?" Ayrıca insanların günlük selamlaşması haline geldi. Bunlardan bahsetmişken, nükleik asit tespitinde hangi temel hammaddelere ihtiyaç duyulduğunu biliyor musunuz? Bu makale, nükleik asit tespit enzimindeki kritik temel hammaddeyi tanıtacaktır.

1. SARS-CoV-2 için nükleik asit tespit süreci

2. Nükleik asit ekstraksiyonunda temel enzimler

3. RT-qPCR sırasında çekirdek enzimler

4. Yeasen'den SARS-CoV-2 Nükleik Asit Tespiti Çekirdek Enzimleri

1. SARS-CoV-2 için nükleik asit tespit süreci

Enzim, yüksek katalitik etkinlik ve reaksiyon özgüllüğüne sahip son derece önemli bir biyokatalizör sınıfıdır. Çoğu biyokimyasal reaksiyon enzimlerin katılımını gerektirir. 2019-nCoV'nin nükleik asit tespiti sürecinde (Şekil 1'de gösterilmiştir), farklı tipteki moleküler enzimler nükleik asit ekstraksiyonu ve RT-qPCR gibi farklı deneysel aşamalarda önemli bir rol oynar. Daha sonra, nükleik asit tespitindeki farklı deneysel bağlantılara göre, nükleik asit tespit sürecinde kullanılan çekirdek enzim ham maddelerini sıralayacağız.

Şekil 1. SARS-CoV-2 için nükleik asit tespit süreci

2. Nükleik asit ekstraksiyonunda çekirdek enzimler

Yeni koronavirüs nükleik asit çıkarma işlemi esas olarak iki adımı içerir: lizis ve saflaştırma. Lizis, numunedeki nükleik asidin lizis sisteminde serbest kalması için numunenin hücre yapısının yok edilmesi işlemidir; Saflaştırma, nükleik asidin lizis sistemindeki protein, tuz ve diğer safsızlıklar gibi diğer bileşenlerden tamamen ayrılmasıdır ve reaksiyon süreci proteinase K, deoksiribonükleaz I ve RNase inhibitörlerinin katılımını gerektirir.

2.1 Proteaz K

Proteinase K, geniş kesme aktivitesine sahip bir serin proteazdır, kesme bölgeleri alifatik ve aromatik amino asitlerin karboksi-terminal peptit bağlarıdır (Şekil 2). Nükleik asit çıkarma sürecinde, proteinase K, nükleik asitlerle sıkı bir şekilde bağlanmış histonları parçalayabilir, nükleik asitlerin ayrılmasını teşvik edebilir ve örnek nükleik asidin çıkarılmasını kolaylaştırabilir. Ek olarak, proteinase K, RNA hidrolaz (RNase) aktivitesini parçalayabilir ve şablon RNA'nın RNase hidrolizini engelleyebilir.

Şekil 2. Proteinase K'nin peptit bağlarını hidrolize etmesinin şematik diyagramı

Yeasen Biyoteknoloji Proteinaz K (Cat#10401ES) rekombinant maya suşundan türetilmiştir, özgül aktivitesi ≥30 U/mg, RNase ve DNase'den arındırılmış ve üre ve SDS solüsyonunda stabil enzim aktivitesine sahiptir. Geniş bir pH aralığında (pH 4.0~12.0) aktiftir, in situ hibridizasyon numune hazırlama ve nükleik asit saflaştırma gibi proteinlerin ayrılması ve uzaklaştırılması için uygundur.

2.2 Deoksiribonükleaz I

Deoksiribonükleaz I (DNase I), DNA'nın çeşitli formlarını katalize edebilir, pirimidinlere bitişik fosfodiester bağlarının kesilmesini hedef alabilir ve 5' ucunda bir fosfat grubu ve 3' ucunda bir hidroksil grubu bulunan polinükleotidler üretebilir, ortalama sindirim ürünü en küçük politetranükleotiddir.SARS-CoV-2 nükleik asit ekstraksiyon sürecinde DNase I esas olarak RNA örneklerindeki genomik kontaminasyonu gidermek, RNA şablonlarındaki DNA kalıntılarını önlemek ve şablonların saflığını artırmak için kullanılır.

Yeasen Biyoteknoloji DNaz I (Cat#10325ES) rekombinant E. coli suşlarından türetilmiştir, RNase içermez ve çeşitli RNA örneklerinin tedavisinde kullanılabilir. optimum çalışma pH aralığı 7,0-8,0'dır. Mg2+ varlığında, DNase I çift sarmallı DNA'nın herhangi bir yerini rastgele kesebilir; Mn varlığında ise²⁺DNase I, aynı bölgede çift sarmallı DNA'yı keserek künt uçlar veya 1-2 nükleotidlik çıkıntılı yapışkan uçlar oluşturabilir (Şekil 3'te gösterilmiştir).

Şekil 3. Mg varlığında DNase I'in dsDNA'yı kesmesinin şematik diyagramı²⁺ ve Mn²⁺

2.3 RNaz inhibitörü

SARS-CoV-2 nükleik asit tespiti sürecinde, örnek nükleik asidin ekstraksiyonu ve saflaştırılması veya deneysel reaksiyon sisteminin hazırlanması ribonükleaz (RNase) kontaminasyonuna neden olabilir ve bu da RNA şablonunun bozulmasına yol açabilir. RNase kontaminasyonunu önlemek için RNase İnhibitörü gereklidir.

RNase İnhibitörü, insan plasentasında bulunan, RNase'yi kovalent olmayan bir bağ ile kompleks oluşturacak şekilde bağlayabilen ve RNase'yi inaktif hale getirebilen spesifik bir RNase inhibitörüdür. Yeasen Biotech Fare RNaz İnhibitörü (Cat#10603ES) insan proteinlerinde oksidasyona karşı çok hassas olan iki sistein içermez. Daha yüksek antioksidan aktiviteye sahiptir ve çeşitli RNaz tiplerini (RNase A, B, C) yaygın olarak inhibe edebilir, qPCR gibi yüksek dithiothreitole (DTT) duyarlı deneyler için daha uygundur.

3. RT-qPCR sırasında çekirdek enzimler

SARS-CoV-2 örneğinin nükleik asit ekstraksiyonu tamamlandıktan sonra, nükleik asit tespiti RT-qPCR ile tamamlanabilir. Bu deneyler sürecinde, DNA polimeraz, ters transkriptaz ve urasil DNA glikozilaz, hepsi temel çekirdek enzim hammaddeleridir.

3.1 Ters transkriptaz

Çıkarma ve saflaştırmadan sonra, SARS-CoV-2 RNA'nın şablon RNA'ya tamamlayıcı bir cDNA dizisi oluşturmak için dNTP polimerizasyonunu katalize etmek için ters transkriptaza ihtiyacı vardır (Şekil 4). RT-qPCR reaksiyonu için yüksek sıcaklığa dayanıklı ters transkriptaz seçilmelidir. Şu anda, MMLV ters transkriptaz en yaygın kullanılanıdır, çünkü DNA endonükleaz aktivitesinin olmaması ve düşük RNase H aktivitesi nedeniyle cDNA klonlama uygulamasında daha fazla avantaja sahiptir.

Şekil 4. Ters transkripsiyon sürecinin şematik diyagramı

Yeasen Biyoteknoloji Hifair™ V Ters Transkriptaz (Cat#11300ES) genetik mühendislik teknolojisiyle elde edilen yeni bir ters transkriptazdır. İyi termal stabiliteye sahiptir ve 60°C'ye kadar reaksiyon sıcaklıklarına dayanabilir. Ayrıca Karmaşık ikincil yapılara sahip RNA şablonlarının ters transkripsiyonu için uygundur. Aynı zamanda, enzim şablonla afiniteyi artırır, az sayıda şablonun ve düşük kopya geninin ters transkripsiyonu için uygundur ve cDNA'yı 10 kb'ye kadar çoğaltabilir.

3.2 DNA polimeraz

Şablon ters transkripsiyon işlemi tamamlandıktan ve çift sarmallı cDNA oluşturulduktan sonra, PCR reaksiyonunda "soul player" DNA polimerazının ortaya çıkması, serbest deoksiribonükleotidlerin polimerize edilmesiyle DNA zincirinin uzatılması ve viral nükleik asit tespiti amacına ulaşmak için çok miktarda şablon DNA'nın in vitro çoğaltılması gerekir.

RT-qPCR reaksiyonlarında yaygın olarak kullanılan DNA polimerazı, sıcak başlatmalı Taq DNA polimerazıdır. Bu enzim türü oda sıcaklığında inaktiftir.Sadece sıcak başlatmadan sonra polimerizasyon aktivitesine sahiptir, bu da arka plan sinyallerinin oluşumunu en aza indirebilir. Konvansiyonel PCR reaksiyonlarında primer-dimer oluşumu veya uyumsuzluğun neden olduğu spesifik olmayan amplifikasyon sorunlarını çözer. Şu anda, yaygın olarak kullanılan DNA polimeraz sıcak başlatma modifikasyon yöntemleri esas olarak kimyasal modifikasyon, ligand modifikasyonu ve antikor modifikasyonunu içerir. Farklı sıcak başlatma modifikasyon yöntemlerinin prensipleri Şekil 5'te gösterilmiştir.

Şekil 5. Farklı tipte modifiye edilmiş sıcak başlatma enzimlerinin şematik diyagramı

Yeasen Biyoteknoloji UNICONTM Hotstart Yüksek Spesifik Taq DNA Polimerazı, 5 U/μL (Cat#10726ES) yüksek şablon afinitesine sahip çift blokajlı sıcak başlangıçlı bir DNA polimerazdır. Oda sıcaklığında, yalnızca 5'→3' polimeraz aktivitesi engellenir, ancak aynı zamanda 5'→3' ekzonükleaz aktivitesi bloke edilir. 95°C'de 30 saniye boyunca denatürasyon, bloke eden antikoru tamamen etkisiz hale getirerek DNA polimeraz aktivitesini ve ekzonükleaz aktivitesini serbest bırakabilir. Çift bloke etme özelliği, yalnızca uyumsuzluklar veya primer-dimerler tarafından neden olunan spesifik olmayan amplifikasyonu etkili bir şekilde önlemekle kalmaz, aynı zamanda prob bozulmasından kaynaklanan floresan sinyalinin azalmasını da etkili bir şekilde engeller. Çift garanti, in vitro tespit reaktiflerini taşıma veya oda sıcaklığında kullanım sırasında daha kararlı hale getirir.

3.3 Urasil DNA glikozilaz

Yeni koronavirüs nükleik asit tespiti sürecinde, çalışma ortamındaki aerosol kirliliği, yanlış pozitif PCR sonuçlarına neden olan en yaygın faktördür. Amplifikasyon sistemine UDG enzimi (Urasil DNA Glikosilaz, urasil DNA glikozilaz) eklenmesi, PCR sisteminde karıştırılan amplifikasyon kalıntı kirleticilerini (çoğunlukla aerosol formunda) etkili bir şekilde ortadan kaldırarak amplifikasyon sonuçlarının doğruluğunu garanti edebilir. UDG enziminin kirlilik önleme prensibi Şekil 6'da gösterilmiştir.

Şekil 6. UDG enziminin kirlilik karşıtı prensibinin şematik diyagramı

Yeasen Biyoteknoloji Urasil DNA Glikosilazı (UDG/UNG), ısıya duyarlı, 1 U/μL (Cat#10303ES) 25-37°C'de aktiftir, ısıya duyarlıdır ve 10 dakika boyunca 50°C'de veya 2 dakika boyunca 95°C'de geri dönüşümsüz olarak inaktive edilir. Endonükleaz ve RNaz kalıntısı yoktur ve konak bakteri genom kalıntısı 10 kopyadan azdır. Amplifikasyon reaksiyonunun özgüllüğünü sağlamak için sıcak başlatmalı Taq DNA polimerazı ile birlikte kullanılabilir.

4.Yeasen'den SARS-CoV-2 Nükleik Asit Tespiti için Çekirdek Enzimler

Okuma ile ilgili olarak:

Ters Transkriptaz Seçimi

YEASEN Isıya duyarlı UDG——Aerosol kirliliğini kolayca kontrol edin

Fare RNaz İnhibitörleri-RNaz kontaminasyonunu başarıyla ortadan kaldırın ve RNA'yı koruyun