İnsanlar sağlıkla ilgili endişelere giderek daha fazla dikkat ettikçe, in vitro tanı (IVD) alanı hızla gelişiyor. Özellikle COVID-19'un ortaya çıkması IVD pazarının genişlemesini hızlandırdı. Şu anda, RT-qPCR IVD tanı reaktif ürünlerinin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılıyor, ancak RT-qPCR sıvı tanı reaktiflerinin yüksek nakliye maliyetleri, dengesiz performansı ve kısa raf ömrü vardır. Kurutma reaktifleri, RT-qPCR sıvı tanı reaktiflerinin eksikliklerini mükemmel bir şekilde aşabilir. Peki kurutma reaktifleri nasıl yapılmalıdır? Üretim yöntemi nasıl seçilmelidir?

1. Kurutma reaktifleri nelerdir?

2. Hava kurutma nedir?

3. Liyofilizasyon nedir?

4. Liyofilizasyon ile hava kurutma arasındaki fark nedir?

5. İlgili ürünler ve performans

1. Kurutma reaktifleri nelerdir?

Kurutma reaktifleri, numune kurutulduktan ve susuzlaştırıldıktan sonra elde edilen reaktiflerdir. Kurutma reaktifleri oda sıcaklığında teslim edilebilir ve soğuk zincir nakliyesi gerektirmez. Reaktiflerin performansını ve raf ömrünü etkileyecek şekilde tekrar tekrar dondurulup çözülmesini önleyebilir ve nakliye maliyetini büyük ölçüde azaltabilir. İnsanların kullanımı kolay olmakla kalmaz, aynı zamanda operatörler üzerindeki talepleri de azaltır. Moleküler teşhis endüstrisi, öncelikle oda sıcaklığında taşınabildikleri ve saklanabildikleri için kurutma reaktifleriyle ilgilenmektedir. Şu anda yaygın olarak kullanılan iki kurutma tekniği vardır: liyofilizasyon ve hava kurutma. Hava kurutma teknolojisi daha ucuzdur, liyofilizasyon teknolojisi ise en popüler olanıdır ve her ikisinin de avantajları vardır. Kurutma reaktiflerinin iki üretim yöntemi vardır: hava kurutma ve liyofilizasyon. Bunlar nelerdir ve nasıl seçilmelidir?

2. Hava kurutma nedir?

Hava kurutma, kurutma reaktiflerini hazırlamak için kullanılabilen bir kurutma tekniğidir. Hava kurutma üç işleme ayrılır: doğal hava kurutma, sıcak hava kurutma ve taklit doğal hava kurutma. Endüstriyel üretim sürecinde, ürün kalitesinin ve çıktısının istikrarını sağlamak için reaktif genellikle sıcak hava kurutma ile kurutulur. IVD teşhis reaktifleri için, genellikle sıvıyı oda sıcaklığından daha yüksek bir sıcaklıkta kurutmak için üfleyici veya vakum işlevine sahip hassas bir fırın kullanılır (80 dakika boyunca 50°C'de kurutma), Sıvı, viskoz kuru bir malzemeye hava ile kurutulur. Belirli işlem Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şekil 1. Sıcak Hava Kurutma

Sıvı moleküler reaktifleri kurutmanın anahtarı, sadece enzimin kurutulduktan sonra hızla nemlendirilmesini sağlamak değil, aynı zamanda kurutulmuş reaktiflerin stabilitesinin, duyarlılığının ve özgüllüğünün etkilenmemesini sağlamaktır. Hava kurutma sadece hassas bir fırın gerektirir. Liyofilizasyonla karşılaştırıldığında, ekipman daha ucuzdur ve enerji tüketimi daha düşüktür, bu nedenle reaktiflerin maliyeti daha düşüktür. Ayrıca, hava kurutma işlemi basittir ve kurutma süresi daha kısadır (2 saat içinde). Hava kurutmanın hem avantajları hem de dezavantajları vardır. Hava kurutma işlemi sırasında, enzimler de dahil olmak üzere çeşitli bileşenler suyun buharlaşmasıyla kaybolacaktır. Sadece bu değil, reaksiyon çözeltisi ve bileşenleri de 50 °C'lik yüksek sıcaklıktan zarar görecektir. Bazı bileşenler daha kolay oksitlenir, bu nedenle hava kurutulmuş reaktiflerin raf ömrü daha kısa olacaktır. Ayrıca, hava kurutma reaktifi güçlü bir viskoziteye sahiptir ve duvara asılması kolaydır ve zayıf bir yeniden nemlendirme yeteneğine sahiptir.Hava kurutmanın eksiklikleri liyofilizasyonla giderilebilir.

3. Liyofilizasyon nedir?

Hava kurutmadan farklı olarak liyofilizasyon, temel prensibi suyun üç fazlı değişimine dayanan özel bir kurutma teknolojisidir. Suyun üç fazı katı, sıvı ve gazdır ve üç faz bir arada bulunabilir ve birbirini dönüştürebilir. Basınç 610,75 Pa'dan büyük olduğunda, sıcaklık arttıkça buz suya dönüşür ve su buharlaşarak buhara dönüşür. Basınç 610,75 Pa'dan düşük olduğunda, buz ısıtılarak doğrudan su buharına süblimleşir. Özellikle Şekil 2'de gösterildiği gibi. Liyofilizasyon, suyun faz geçişi prensibini kullanır. İlk olarak, sıvı reaktifler -30℃~-40℃'ye dondurulur, böylece malzemedeki nemin çoğu buza dondurulur. Buz, daha yüksek bir vakumda su buharına süblimleşir ve düşük sıcaklıkta bir ısı kaynağı sağlanır. Su buharı, vakum sistemindeki bir kondansatör tarafından yoğunlaştırılır, böylece diğer malzeme buzun içinde kalır ve böylece kurutulmuş ürünler elde edilir.

Şekil 2. Su için Faz Diyagramı

Peki liyofilize reaktiflerin ana formları nelerdir? IVD liyofilize reaktifler esas olarak üç forma ayrılır: Penisilin Şişe Liyofilizasyonu, yerinde Liyofilizasyon ve Liyofilize Mikroküre. Üç liyofilize formülasyon Şekil 3'te gösterilmiştir. Farklı formların avantajları ve dezavantajları vardır. Penisilin Şişe Liyofilizasyonu en endüstriyel formdur. Sadece tam otomatik üretim hatlarına sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda eksiksiz bir doğrulama ve risk kontrol sürecine de sahiptir. İşlem en basit ve en olgun olanıdır. Dezavantajı, bir Penisilin şişesinin maliyetinin yüksek olması ve dolum miktarının çok küçük olmaması gerektiğidir. Ancak, her IVD reaktifinin miktarı çok azdır, bu nedenle birden fazla porsiyon için doldurulması veya bir seferde birden fazla kez kullanılması gerekir. Kullanılmazsa, ayrı ayrı saklanması gerekir ve kullanışlı değildir.

Yerinde Liyofilizasyon, reaktifin tüm bileşenlerinin kitte doğrudan dondurularak kurutulması anlamına gelir, bu da kullanımı daha kolaydır. Ancak, liyofilizatördeki soğuk ve ısı dağılımı önyargılıdır ve kitlerin yerleşimi de farklıdır, bu nedenle partilerin tutarlılığını kontrol etmek zordur. Ayrıca, yerinde liyofilizatörlerin kullanım oranı çok düşüktür, bu nedenle amortisman maliyeti yüksektir. Çok miktarda yerinde Liyofilizasyon yapılırsa, liyofilize tozlar çapraz kontaminasyona uğrayacaktır.

Şekil 3. Liyofilize Reaktiflerin Formu

Liyofilize Mikroküre doğru kantifikasyona ulaşabilir, tek kişi ve tek porsiyon, ürün kullanımı daha uygundur. Ayrıca nem emilimini önlemek, oda sıcaklığında depolama elde etmek ve aynı anda birden fazla sorun noktasını çözmek için özel bir işlemle işlenebilir. Dezavantajı, Liyofilize Mikroküre teknolojisinin geliştirilmesinin zor olması ve işlem kontrolü gereksiniminin yüksek olmasıdır. Liyofilize reaktiflerin uygulama sahnelerine göre en iyi formu seçmesi gerekir. Liyofilize Mikroküre benzersiz avantajlara sahiptir ve pazarda daha umut verici olan çeşitli uygulama sahneleri için uygundur.

4. Liyofilizasyon ile hava kurutma arasındaki fark nedir?

Liyofilizasyonun benzersiz süreci, benzersiz avantajlarını belirler. Hava kurutma ile karşılaştırıldığında, liyofilizasyon birçok açıdan hava kurutmadan üstündür. Liyofilizasyonun avantajları şunlardır:

Liyofilizasyon düşük sıcaklıkta gerçekleştirildiği için enzim denatüre olmaz, biyolojik aktivitesini kaybetmez ve biyolojik aktivitesi tamamlanır.Kurutma donmuş halde gerçekleştirildiğinden, kurutma reaktiflerinin hacmi neredeyse hiç değişmez ve orijinal yapı Büzülmeden korunur. Düşük sıcaklıkta kurutma yapıldığında, kurutma reaktiflerindeki bazı uçucu bileşenlerin kaybı çok azdır ve bu da reaktif kurutma için uygundur. Kurutma sırasında malzemenin yüzeyinde inorganik tuzlar çökelmeyecek ve malzemenin yüzey sertleşmesi önlenecektir. Kurutulan malzeme gevşek ve gözeneklidir, su eklendikten sonra hızla ve tamamen çözülür ve hemen hemen orijinal karakterine geri döner. Kurutma çok az oksijenle vakum altında gerçekleştirildiğinden, bazı kolay oksitlenebilen maddeler korunur. Kurutma, nemin %95 ila %99'undan fazlasını giderebilir, böylece kurutulmuş ürünler bozulmadan uzun süre saklanabilir.

Liyofilizasyon ile hava kurutma arasındaki temel farklar şunlardır:

Tablo 1. Liyofilizasyon ve Hava Kurutma Arasındaki Farklar

Liyofilize reaktifler daha pahalı ve daha uzun sürse de, liyofilizasyonla üretilen reaktifler daha kararlıdır ve kullanımı daha kolaydır, bu da tam olarak teşhis reaktiflerinin geliştirme yönüyle uyumludur. Bu nedenle, bu teknolojinin ortaya çıkmasından bu yana giderek daha popüler hale gelmiştir. Hastalık tespiti, virüs ve patojen tespiti, gıda güvenliği tespiti, hayvan tespiti ve çevre tespiti gibi çeşitli alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

5. İlgili ürünler ve performans

IVD tanı reaktiflerinde hammaddeler anahtardır.Dondurularak kurutulmamış malzemeler, dondurularak kurutulmuş malzemelerden doğrudan çıkarılamaz ve her bileşenin taranması ve hata ayıklaması gerekir. Bu nedenle, Yeasen Biotechnology bu yöndeki yatırımlarını sürekli olarak artırmakta ve müşterilerine hızla pazara sunulan yüksek kaliteli ve kararlı liyofilize hammaddeler sağlamaya çalışmaktadır.

Yeasen'in sağlayabileceği ilgili ürünler Tablo 2'de gösterilmektedir:

Tablo 2. Ürün Listesi

Hieff Unicon® V Lyo-nCoV Multiplex Tek Adımlı RT-qPCR Kiti (MgCl2 ile) (Kat#13775) gliserol içermeyen, liyofilizasyona uygun (lyo-ready) sıvı tanı reaktifi. Bu ürün, oda sıcaklığında kararlılığa sahip ve oda sıcaklığında sevk edilebilen ve saklanabilen multipleks RT-qPCR'nin geliştirilmesi için ideal bir seçimdir.

Performans: Psödovirüs şablonu, sırasıyla sıvı reaktifler (kırmızı) ve 13775 liyofilize reaktifler (mor) kullanılarak çoklu RT-qPCR ile çoğaltıldı. Soldaki grafik FAM kanalı, sağdaki VIC kanalıdır. Sonuçlar, 13775 reaktiflerinin aktivitesinin liyofilizasyondan sonra bozulmadığını ve hala yüksek verimli çoklu reaksiyon yeteneğine sahip olduğunu gösterdi. Özellikle Şekil 4'te gösterildiği gibi.

Şekil 4. Liyofilizasyondan Sonra 13775 Ürününün Performansı

13775 liyofilize reaktif, çoklu RT-qPCR amplifikasyon testleri için 21 gün boyunca 37°C'ye (yeşil) ve -20°C'ye (mavi) yerleştirildi. Soldaki grafik FAM kanalı, sağdaki VIC kanalıdır. Sonuçlar, liyofilize reaktifin 21 gün boyunca 37°C'ye yerleştirildikten sonra bile hala iyi bir amplifikasyon etkisine sahip olduğunu gösterdi. Özellikle Şekil 5'te gösterildiği gibi.

Şekil 5. 13775 Liyofilize Reaktifin 21 Gün Boyunca 37°C'de Termal Kararlılığı.

6.Ürün Seçim Rehberi

İşlem	Tanım	Ürün adı	Stok Kodu
Örnek işleme	Protein sindirimi	Proteinaz K	10401ES
	RNA ekstraksiyonu	Rekombinant DNase I (RNase içermeyen)	10325ES
	RNaz inhibisyonu	Fare RNaz inhibitörü (40 U/μL)	10603ES
Ters transkripsiyon	RT-qPCR için uygundur	Hifair V Ters Transkriptaz (200U/ μL)	11300ES
		Hifair V Ters Transkriptaz (600U/ μL) GLyceroL- içermez	11301ES
PCR amplifikasyonu	Sıcak başlangıçlı DNA polimeraz	Hieff UNICON Hotstart E-Taq DNA Polimerazı	10726ES

Okuma ile ilgili olarak:

COVID-19 nükleik asit tespiti hammadde çözümü: hızlı, dondurularak kurutulmuş

Yeasen Biology'nin Afrika Domuz Vebası Virüsü Tespiti İçin Genel Çözümü

Afrika Domuz Vebası Virüsü - Toplam Ana Karışım/Doğrudan Amplifikasyon qPCR Çözümü