Ct değeri, floresan kantitatif PCR'de önemli bir sonuç gösterimidir. Gen ifadesi seviyelerindeki veya gen kopyası sayılarındaki farklılıkları hesaplamak için kullanılır. Peki, floresan kantitasyonunda hangi Ct değeri aralığı makul kabul edilebilir? Ct değerlerinin etkili bir aralıkta olduğundan nasıl emin olabiliriz? Bugün, Xiao Yi'nin bu soruyu herkes için yanıtlamasına izin verelim.
Ct değeri nedir?
qPCR amplifikasyon sürecinde, Ct değeri amplifikasyon döngüsü sayısını (Döngü Eşiği) ifade eder; amplifikasyon ürünü floresan sinyalinin ayarlanan floresan eşiğine ulaştığı. "C" Döngü anlamına gelir ve "T" Eşik anlamına gelir. Basitçe ifade etmek gerekirse, Ct değeri qPCR'deki başlangıç şablonunun belirli bir miktarda ürüne ulaşması için geçen döngü sayısıdır; bu daha sonra daha ayrıntılı olarak açıklanacaktır.
Ct değerinin işlevi nedir?
1. Üstel Amplifikasyon, Şablon Miktarı ve Ct Değeri Arasındaki İlişki
İdeal bir senaryoda, qPCR sırasında genler üssel olarak çoğaltılır ve belirli sayıda döngü boyunca birikir. Çoğaltma döngüleri sayısı ile ürün miktarı arasındaki ilişki şu şekilde ifade edilebilir: çoğaltılan ürün miktarı = başlangıç şablon miktarı×(1 + En)^döngü sayısı. Ancak, qPCR reaksiyonları her zaman ideal koşullar altında gerçekleşmez. Çoğaltılan ürün miktarı "belirli bir ürün miktarına" ulaştığında, bu noktadaki döngü sayısı, üssel çoğaltma periyodunu gösteren Ct değeridir. Ct değeri ile başlangıç şablon miktarı arasındaki ilişki şu şekildedir: bir şablonun Ct değeri ile o şablonun başlangıç kopya sayısının logaritması arasında doğrusal bir ilişki vardır. Başlangıç şablonunun daha yüksek konsantrasyonu daha düşük bir Ct değeriyle sonuçlanırken, başlangıç şablonunun daha düşük konsantrasyonu daha yüksek bir Ct değerine yol açar.
2. Amplifikasyon Eğrisi, Floresan Eşiği ve Belirli Bir Ürün Miktarı
qPCR amplifikasyon ürünlerinin miktarı, amplifikasyon eğrisi olarak bilinen floresan sinyalleri biçiminde doğrudan temsil edilir. PCR'nin erken aşamalarında, amplifikasyon ideal koşullar altında olduğunda ve döngü sayısı düşük olduğunda, ürün birikimi minimumdur ve üretilen floresan seviyesi arka plan floresan gürültüsünden önemli ölçüde ayırt edilemez. Daha sonra, floresan üretimi üstel faza girer. PCR ürününün miktarı, reaksiyonun üstel faza yeni girdiği belirli bir noktada tespit edilebilir ve buna "belirli ürün miktarı" denir. Bu, şablonun başlangıç içeriğini çıkarmak için kullanılabilir. Bu nedenle, belirli ürün miktarına karşılık gelen floresan sinyal yoğunluğu floresan eşiği olarak bilinir.
PCR'nin ileri evrelerinde amplifikasyon eğrisi artık üstel amplifikasyon göstermez ve doğrusal faza ve plato fazına girer.
3.Ct değerlerinin tekrarlanabilirliği
PCR döngüleri Ct değerinin oluştuğu döngü sayısına ulaştığında, gerçek üstel amplifikasyon fazına yeni girmektedir. Bu noktada, küçük hatalar amplifiye edilmemiştir, bu nedenle Ct değerlerinin tekrarlanabilirliği mükemmeldir. Bu, aynı şablonun farklı zamanlarda veya aynı anda farklı tüplerde amplifiye edilmesinden bağımsız olarak elde edilen Ct değerlerinin sabit kaldığı anlamına gelir.
Ct değerlerinin aralığı nedir?
1.Amplifikasyon verimliliği En
PCR amplifikasyon verimliliği, polimerazın hedef geni amplifikasyon ürünlerine dönüştürme verimliliğini ifade eder.Bir DNA molekülü iki DNA molekülüne dönüştürüldüğünde amplifikasyon verimliliği %100'dür. Amplifikasyon verimliliği genellikle En olarak gösterilir. Sonraki makalelerde analiz kolaylığı için, amplifikasyon verimliliğini etkileyen faktörlere ilişkin kısa bir giriş aşağıdadır.
| Etkileyen Faktörler | Açıklama | Yargılamalar |
| A. PCR İnhibitörleri | 1. Şablon RNA, proteinler veya deterjanlar gibi PCR reaksiyonunu engelleyen maddeler içerebilir. 2. Ters transkripsiyondan sonra elde edilen cDNA, yüksek konsantrasyonlarda şablon RNA ve ters transkripsiyon reaktiflerinin bileşenlerini içerebilir ve bu da sonraki PCR'yi inhibe edebilir. | 1. Kontaminasyonun varlığı A260/A280 ve A260/A230 oranlarının ölçülmesiyle veya RNA elektroforezi yapılarak değerlendirilebilir. 2. Ters transkripsiyon sonrasında cDNA’nın belirli bir oranda seyreltilip seyreltilmediği. |
| B. Mantıksız astar tasarımı | Astar etkili bir şekilde tavlanamıyor. | Primerlerde dimer veya saç tokası yapılarının olup olmadığını, uyumsuzluk olup olmadığını kontrol etmek gerekir; bazen intronları kapsayan tasarıma dikkat etmek gerekir. |
| C. Uygun olmayan reaksiyon prosedürü | 1. Primerler etkili bir şekilde tavlanamaz. 2. DNA polimeraz aktivitesi tam olarak serbest bırakılmamıştır. 3. Uzun süreli yüksek sıcaklıklara maruz kalındığında DNA polimeraz aktivitesi azalır. | 1. Tavlama sıcaklığı primerin Tm değerinden yüksektir. 2. Ön denatürasyon süresi çok kısadır. 3. Reaksiyon protokolündeki her aşamanın süresi çok uzundur. |
| D. Reaktifler iyice karıştırılmamış veya pipetleme hataları | Reaksiyon sisteminde PCR reaksiyon bileşenlerinin lokal konsantrasyonu çok yüksek veya düzensizdir ve bu durum PCR'nin üstel olmayan amplifikasyonuyla sonuçlanır. | / |
| E.Amplikon uzunluğu | Amplikon uzunluğu çok uzundur, 300 baz çiftini aşar ve bu da düşük amplifikasyon verimliliğine neden olur. | Amplikon uzunluğunun 80 baz çifti ile 300 baz çifti arasında olup olmadığını kontrol edin. |
| F.qPCR reaktiflerinin etkisi | Reaktiflerdeki DNA polimeraz konsantrasyonunun düşük olması veya tampondaki iyon konsantrasyonlarının optimumun altında olması, Taq enziminin maksimum aktivitesine ulaşamamasına neden olur. | Primerlerin amplifikasyon etkinliğini ölçmek için standart eğri kullanılır. |
2.Ct değerlerinin aralığı
Ct değerlerinin aralığı 15-35'tir. 15'ten düşük bir Ct değeri, temel faz içinde kabul edilir ve floresan eşiğine ulaşmamıştır. İdeal olarak, Ct değeri ile şablonun başlangıç kopya sayısının logaritması arasında doğrusal bir ilişki vardır ve bu standart eğri olarak bilinir. Standart eğri kullanılarak, amplifikasyon verimliliği %100 olduğunda, genin tek bir kopyasını ölçmek için Ct değeri yaklaşık 35 olarak hesaplanır. Ct değeri 35'ten büyükse, teorik olarak şablonun başlangıç kopya sayısı 1'den küçüktür ve bu istatistiksel olarak önemsiz kabul edilebilir.
Farklı genler için, gen kopyalarının başlangıç şablon miktarındaki ve amplifikasyon verimliliğindeki farklılıklar nedeniyle Ct değer aralığı, genin doğrusal tespit aralığını hesaplamak için o gen için standart bir eğri oluşturulmasını gerektirir.
3.Ct değerlerini etkileyen faktörler
Amplifikasyon çevrimi sayısı ile ürün miktarı arasındaki ilişkiden de anlaşılacağı gibi: Amplifikasyon ürünü miktarı = Başlangıç şablon miktarı × (1 + En)^çevrim sayısı, ideal koşullar altında başlangıç şablon miktarı ve En'nin Ct değerini etkileyeceği görülebilir. Şablon kalitesindeki veya amplifikasyon verimliliğindeki farklılıklar Ct değerinin çok yüksek veya çok düşük olmasına neden olabilir.
4. Ct değerlerinin çok yüksek veya çok düşük olması
Xiao Yi, firmamızın teknik departmanındaki uzmanlara danıştı ve okuyucularımızı aydınlatmak amacıyla Ct değerleriyle ilgili iki yaygın sorun türünün nedenlerini ve çözümlerini özetledi.
| Sorun | Nedenler | Çözümler |
| Ct değeri çok yüksek | Şablon konsantrasyonu düşüktür veya PCR inhibitörleri mevcuttur. Amplifikasyon verimi düşüktür. | 1. Şablon konsantrasyonunu artırın; veya RNA veya cDNA'nın seyreltme oranını artırın; veya şablonu tekrar hazırlayın. 2. Tavlama sıcaklığını düşürün veya iki aşamalı bir amplifikasyon yöntemi kullanın; bileşenlerin ve sistemin iyice karıştırıldığından emin olun; reaksiyon protokolünü optimize edin; veya reaktifleri değiştirmeyi deneyin. |
| Ct değeri çok düşük | 1. Yüksek şablon konsantrasyonu 2. NTC'de (Şablon Kontrolü Yok) ve NRC'de (Ters Kontrol Yok) Kontaminasyon 3. Uygunsuz astar tasarımı | 1. Şablon RNA miktarını azaltın; veya cDNA'yı daha yüksek bir oranda seyreltin. 2. Tüm reaktifleri yeniden değiştirin veya UDGase kontaminasyon önleyici reaktifleri kullanın. 3. Spesifik olmayan amplifikasyondan kaçınmak için prosedürü optimize edin. |
Bu, bu soruna neden olan anormal Ct değeri nedenlerinin analizini sonlandırır. Ardından, Xiao Yi deneysel verilerinizin daha doğru ve güvenilir olmasını sağlamak için bir dizi uygun maliyetli ürün önerecektir. Gelin ve favorilerinizi seçin!
| Ürün Adı | Kedi# | Boyut |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Yeşil Ana Karışım | 11184ES08 | 5×1 mL |
| Hifair™ Ⅲ 1. Zincir cDNA Sentezi qPCR için SuperMix (gDNA sindirici artı) | 11141ES60 | 100 Ton |
| Hifair™ AdvanceFast Tek Adımlı RT-gDNA Sindirimi qPCR için SuperMix | 11151ES60 | 100 Ton |
| Hifair™ AdvanceFast 1. Zincir cDNA Sentez Kiti (Boya Yok) | 11150ES60 | 100 Ton |