Floresan kantitatif PCR (qPCR), gen ifadesi analizi, genotipleme, patojen tespiti, SNP analizi ve daha fazlasına uygulanabilen, laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. qPCR'nin çalışması basittir ve prensibi anlaşılması kolaydır. Şimdi, dağınık bir veri yığınıyla karşı karşıya kaldığınızda, sonuçları nasıl analiz edeceğiniz göz korkutucu bir görev haline geliyor. Bugün, Xiao Yi karmaşık süreçleri nasıl basitleştireceğiniz ve SCI dergilerinde yayınlanabilecek verileri nasıl kolayca elde edeceğiniz konusunda size rehberlik edecek!
qPCR'de kullanılan yaygın analiz yöntemleri arasında bağıl kantifikasyon ve mutlak kantifikasyon bulunur ve bu yöntemler arasındaki seçim farklı deneysel tasarımlara dayanmalıdır. Bu sayıda, qPCR'nin yaygın bir uygulamasına odaklanacağız: gen ifadesi analizi, burada genellikle bağıl kantifikasyon yöntemi seçilir.
Deneysel Tasarım
Farz edelim ki şu anda ışık indüksiyonunun Arabidopsis AtSUC2 geninin ekspresyonu üzerindeki etkisini incelememiz gerekiyor. Kontrol grubu herhangi bir işleme tabi tutulmamış Arabidopsis bitkilerinden oluşurken, deney grubu belirli bir ışık indüksiyonuyla tedavi edilmiş bitkilerden oluşacaktır. Her iki gruptan da RNA çıkarılacak ve cDNA elde etmek için ters transkripsiyona tabi tutulacak ve bu daha sonra şablon olarak kullanılacaktır. Arabidopsis GAPDH geni qPCR deneyi için dahili referans olarak seçilecektir.
Kurulması gereken qPCR kuyuları şu şekildedir:
1) NTC (Şablon Yok Kontrolü) PCR sisteminde kontaminasyon olup olmadığını doğrulamak için kullanılır.
2) NRT (Ters Transkripsiyon Yok) gDNA kontaminasyonuna karşı kontrol görevi gören, ters transkripsiyona uğramamış RNA'nın şablon olarak kullanılması anlamına gelir.
3) dahili referans geni Numunelerin başlangıç konsantrasyonlarındaki değişikliklerin neden olduğu farklılıkları düzeltmek için kullanılır.
4) Seçimi kontrol örnekleri genellikle aşağıdaki kategorilere ayrılır:
- Belirli bir tedavinin gen ekspresyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için, tedavi edilmemiş örnek referans örnek olarak kullanılır.
- Farklı zamanlarda gen ifadesindeki farklılıkları tespit etmek için 0. zamandaki örnek referans örnek olarak kullanılır.
- Farklı dokular arasındaki gen ekspresyonu farklılıklarını karşılaştırmak için, bir doku rastgele referans örneği olarak seçilir.
Burada dikkat edilmesi gereken bir nokta, yukarıda belirtilen her bir materyal için 3 PCR kuyusunun (1, 2, 3) kurulmuş olmasıdır. Bunlar, operasyonel hataları ortadan kaldırmak ve amplifikasyon verimliliğini doğru bir şekilde değerlendirmek için tasarlanmış teknik tekrarlar olarak da bilinen PCR tekrarlarıdır. Ek olarak, biyolojik değişkenliği kalibre etmek ve işlemin istatistiksel açıdan önemli olup olmadığını analiz etmek için aynı deneyin farklı materyaller (farklı zamanlar, bitkiler, gruplar, reaksiyon plakaları) üzerinde yürütülmesini içeren biyolojik tekrarların oluşturulması gerekir. Özellikle bu durumda, hem deney grubu hem de kontrol grubu, işlenecek en az iki set daha Arabidopsis örneğine (A, B, C) ihtiyaç duyar. Her setten RNA çıkarılır ve ters transkripsiyon yapılır, ardından qPCR yapılır. İstatistiksel analiz için üç biyolojik tekrarın ortalaması kullanılır.
Sonuç Analizi — ΔΔCt Yöntemi
ΔΔCt yönteminin özelliği, hesaplamada yalnızca Ct değerlerine dayanmasıdır; ancak varsayım, hedef genin ve referans genin amplifikasyon verimliliğinin nispeten tutarlı olması ve her ikisinin de %90-110 aralığında olmasıdır.
Özel hesaplama formülü şu şekildedir:
ΔCt = Ct (hedef gen) - Ct (referans gen)
ΔΔCt = ΔCt (deney grubu) - ΔCt (kontrol grubu)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
Yukarıdaki deneyde ışık indüksiyonunun Arabidopsis AtSUC2 geninin ekspresyonu üzerindeki etkisinin incelendiği varsayıldığında, qPCR sonuçları aşağıdaki gibidir:
Hesaplama sırasında, öncelikle kontrol grubu için 2^-△Ct verilerinin ortalamasını hesaplıyoruz (yukarıdaki şekilde gösterildiği gibi, bu 0,00116'dır). Daha sonra, her bir 2^-△Ct değerini bu ortalamaya bölerek 2^-△△Ct değerini elde ediyoruz. Son olarak, bu değerleri düzenleyerek ortalama ve standart sapmayı elde ediyoruz; bu da deney grubunda hedef genin ifade düzeyinin kontrol grubuna kıyasla yaklaşık 9,73 kat arttığını göstermektedir.
Sonuçlar Graphpad yazılımı kullanılarak aşağıdaki şekilde çizildi:
Yazılımın t-testi kullanılarak hesaplanan P değeri 0,0024 olup, 0,05’ten küçüktür ve istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğunu ve sonuçların güvenilir olduğunu göstermektedir.
Sonuç Analizi — Çift Standart Eğri Yöntemi
Pratik uygulamalarda, hedef genin ve referans genin amplifikasyon verimliliği sıklıkla farklı olduğundan, aynı amplifikasyon verimliliğini elde etmek için primerleri yeniden tasarlamak ve reaksiyon koşullarını optimize etmek gerekir. Ancak, daha kullanışlı bir yöntem olan çift standart eğri yaklaşımını da seçebiliriz.
Burada, öncelikle mutlak kantifikasyonun analiz yöntemini anlayalım. Belirli adımlar, hedef parçayı PCR ile çoğaltmak, ardından hedef parçayı bir klonlama vektörüne yerleştirmek, rekombinant plazmidi çıkarmak ve dizileme doğru olduğunu doğruladıktan sonra standart olarak kullanılabilir. Plazmit DNA miktarı Nanodrop gibi cihazlar kullanılarak ölçülebilir ve kopya sayısı, kopya sayısı dönüştürme formülü kullanılarak belirli plazmit kopyalarına dönüştürülür. Bundan sonra, DNA bir dizi seyreltmenin ardından çoğaltılır. Standart eğri, standart kopya sayısının logaritmasının x ekseni ve ölçülen Ct değerlerinin y ekseni olduğu şekilde çizilir. Bilinmeyen numunenin Ct değerine dayanarak, mutlak kopya sayısı hesaplanabilir.
Kopya sayısı hesaplama formülü:
Kopya sayısı = (kütle ÷ bağıl moleküler kütle) × 6,02 × 10^23
Çift standart eğrisi yöntemi, hedef gen ve referans gen için ayrı ayrı standart örnekler oluşturmayı, mutlak kantifikasyon yapmayı ve standart eğriler oluşturmayı içerir. Bilinmeyen örneklerin mutlak kopya sayısı hesaplandıktan sonra, daha yüksek doğruluk sağlayan bir karşılaştırma yapılır.
Özel hesaplama formülü şu şekildedir:
Q = Hedef gen kopyalarının sayısı / Referans gen kopyalarının sayısı
RQ = Q (deneysel) / Q (kontrol)
Yukarıda bahsi geçen ve ışık indüksiyonunun Arabidopsis AtSUC2 geninin ekspresyonu üzerindeki etkisini araştıran deneyde, hem AtSUC2 hem de GAPDH için standart örnekler oluşturuldu ve aşağıdaki standart eğriler hazırlandı:
Test edilecek örneklerdeki hedef gen ve iç referans genine ait Ct değerleri şu şekildedir:
Hesaplama sırasında, ilk olarak hedef genin ve iç referans geninin Ct değerleri, hem deney hem de kontrol gruplarında hedef genin ve iç referans geninin mutlak kopya sayılarını elde etmek için standart eğrinin doğrusal ilişkisine ikame edilir. Daha sonra, Q = hedef gen kopyalarının sayısı / referans gen kopyalarının sayısı formülü kullanılarak hedef genin ifade düzeyi normalize edilir.Son olarak RQ=Q(deneysel)/Q(kontrol) formülüne göre RQ=9.71 olarak hesaplanmakta olup, hedef genin deney grubundaki ifade düzeyinin kontrol grubuna göre 9.71 kat daha fazla olduğunu göstermektedir.
Sonuçlar GraphPad yazılımı kullanılarak aşağıdaki şekilde çizildi:
Yazılımın t-testi kullanılarak hesaplanan P değeri 0,0008 olup, 0,05’ten küçüktür ve istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğunu ve sonuçların güvenilir olduğunu göstermektedir.
Bu oturum için qPCR veri analizini sonlandırıyoruz. Daha sonra, deneysel verilerinizin daha doğru ve güvenilir olmasını sağlamak için bir dizi uygun maliyetli ürün önereceğim. Gelin ve alın!
| Ürün Adı | Kedi# | Boyut |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Yeşil Ana Karışım | 11184ES08 | 5×1 mL |
| Hifair™ Ⅲ 1. Zincir cDNA Sentezi qPCR için SuperMix (gDNA sindirici artı) | 11141ES60 | 100 Ton |
| Hifair™ AdvanceFast Tek Adımlı RT-gDNA Sindirimi qPCR için SuperMix | 11151ES60 | 100 Ton |
| Hifair™ AdvanceFast 1. Zincir cDNA Sentez Kiti (Boya Yok) | 11150ES60 | 100 Ton |